LAMP-CRISPR Cas12b RNA荧光检测试剂盒（一管法）

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产品简介

本试剂盒将环介导等温扩增技术（LAMP）与CRISPR/AapCas12b核酸酶组合，形成一种具有高灵敏度和特异性的核酸检测技术——夏洛克（SHERLOCK），解决了LAMP技术非特异扩增的短板。通过选择耐高温的AapCas12b核酸酶，实现了单管检测，避免了开盖引起的气溶胶污染和假阳性问题。当AapCas12b酶与sgRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，其针对非特异序列单链DNA的反式剪切活性便会被激活，进而将体系中的荧光探针切碎释放荧光信号，荧光PCR仪或可检测到荧光信号，依据是否出现扩增曲线即可判断扩增阴阳性结果。试剂盒集成了夏洛克反应所需所有酶、dNTP和reporter荧光探针，只需加入引物和sgRNA即可实现单管一步检测。

最低检出限

10~100 copies/test.

产品组成

需要但未提供的材料

qPCR仪、移液器、Nuclease-Free Water.

sgRNA序列设计

5′–GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUG

GCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（粗体区代表scaffold sequence结构序列，下划线区代表sgRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为20-23 nt)。 靶标序列旁需有PAM序列（TTN，N代表G/A/C/U）。建议选用本公司的gRNA制备试剂盒（#30651）。

操作步骤

1、将以下组分加入到无核酸酶的微量离心管中：

2、实时荧光定量 PCR仪检测荧光信号（FAM通道），60℃反应1~2 h，每 1~2 min采集一次荧光信号。

核酸检测示意图

注意事项

1、    建议先通过常规LAMP筛选引物，再进一步在LAMP-CRISPR体系中进行验证。

2、    Cas12b在 sgRNA的引导下，特异性地剪切 target DNA。dsDNA靶标需带有 PAM位点，而 ssDNA靶标不依赖 PAM位点。

3、    Cas12b蛋白对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，并在使用后立即将酶置于-20℃保存。

4、    试剂盒灵敏度非常高，请扩增后不要打开反应管盖子，避免扩增产物形成气溶胶造成后续试验的假阳性结果。

5、    要达到最优检测效果，LAMP引物和sgRNA的加入量需要进行优化。

6、    LAMP引物和sgRNA对于检测效果至关重要，需要设计多组进行筛选。

参考文献

1.    Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing. The New England journal of medicine 2020; 383(15): 1492-4.

2.    Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 2017; 356(6336): 438-42.