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产品编号 30521
规格
Store at: –20℃或–80℃
产品简介 AapCas12b核酸酶是一种由tracrRNA:crRNA（或sgRNA）介导的DNA核酸内切酶。在靶标双链DNA中存在PAM（TTN）序列时，该酶能够特异性地对靶标双链DNA进行剪切，导致DNA双链断裂并产生粘性末端。而AapCas12b对单链DNA靶标的特异性剪切并不依赖PAM序列。此外，无论是双链DNA靶标还是单链DNA靶标，都能够激活AapCas12b的反式剪切活性（也称为旁路剪切活性或附属剪切活性）。具体而言，当AapCas12b酶与sgRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，其针对非特异序列单链DNA（ssDNA）的反式剪切活性便会被激活，进而将体系中任意序列的ssDNA切碎。AapCas12b源自嗜酸耐热菌Alicyclobacillus acidophilus，其最佳剪切反应温度为60℃。与AacCas12b相比，AapCas12b具有更强的耐高温性能。基于这一特性， AapCas12b更适合与环介导等温扩增技术（LAMP）联用，以开发“一管法”恒温扩增/CRISPR - Cas检测体系。另外，AapCas12b还可以与本公司另一款耐高温的TccCas13a核酸酶（#30541）组合，形成单管双重等温扩增试剂。
产品来源
分子量 135 kDa。
质量控制 SDS-PAGE检测纯度大于99%，经检测无外源核酸酶活性和核酸残留。
产品组成
sgRNA序列设计 5′–GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGC CCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（粗体区代表scaffold sequence结构序列，下划线区代表crRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为20-23 nt)。 靶标序列旁需有PAM序列（TTN，V代表G/A/C/U）。 ssDNA Reporter设计 推荐单碱基重复序列，如：5′–FAM/ TTTTTTT /BHQ1–3′。
顺式剪切实验 1、将以下组分加入到无核酸酶的微量离心管中：
注：顺式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被反式激活的Cas12b进一步切碎。对于20 μl顺式剪切应体系，推荐targetDNA的使用量为100ng～500ng，且targetDNA片段长度在300bp～3kb范围内。不同长度targetDNA需要的Cas酶和sgRNA的量需要根据targetDNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:sgRNA:targetDNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。 2、60℃反应 30 min~1 h，85℃灭活 5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。
反式剪切实验 1、将以下组分加入到无核酸酶的微量离心管中：
注：反式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。AapCas12b Nuclease 可用1×Reaction Buffer 稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas13酶长期保存，请使用Cas Dilution Buffer，#30611），crRNA、Target RNA及ssRNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target RNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释，并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。 2、实时荧光定量 PCR仪检测荧光信号，60℃反应，每 30 sec采集一次荧光信号。
注意事项 1、 Cas12b的顺式剪切(cis-cleavage)：Cas12b在 sgRNA的引导下，特异性地剪切 target DNA。dsDNA靶标需带有 PAM位点，而 ssDNA靶标不依赖 PAM位点。 2、 Cas12b的反式剪切(trans-cleavage)：当 target DNA存在时，Cas12b/sgRNA与 target DNA形成三元复合物(Cas12b/sgRNA/target DNA)，同时，Cas12b被激发反式剪切活性，将反应体系中任意序列的单链 DNA切碎。 3、Cas12b蛋白对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，并在使用后立即将酶置于-20℃保存。
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