LbaCas12a (Cpf1)蛋白

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产品简介

LbaCas12a核酸酶源自Lachnospiraceae bacterium ND2006菌株，是一种由crRNA介导的DNA核酸内切酶。在靶标双链DNA存在PAM序列时，它能特异性切割靶标双链DNA，造成DNA双链断裂并产生粘性末端；而切割单链DNA靶标时，不依赖PAM序列。此外，无论是双链还是单链DNA靶标，都能激活LbaCas12a的反式剪切活性（即旁路剪切或附属剪切活性）。当LbaCas12a酶与crRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，会激活其针对非特异序列单链DNA（ssDNA）的反式剪切活性，将体系中任意序列的ssDNA切碎。基于上述特性，LbaCas12a酶不仅适用于体外双链DNA（dsDNA）的特异性切割，还可用于靶标核酸的快速检测。

产品来源

重组E. coli菌株。

分子量

140 kDa。

质量控制

SDS-PAGE检测纯度大于99%，经检测无外源核酸酶活性和核酸残留。

产品组成

crRNA序列设计

5′–UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（粗体区代表scaffold sequence结构序列，下划线区代表crRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为20-23 nt)。 靶标序列旁需有PAM序列（TTTV，V代表G/A/C）。

ssDNA Reporter设计

推荐单碱基重复序列，如：5′–FAM/ TTTTTTT /BHQ1–3′。

顺式剪切实验

1、将以下组分加入到无核酸酶的微量离心管中：

注：顺式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被反式激活的Cas12a进一步切碎。对于20 μl顺式剪切应体系，推荐target DNA的使用量为100～500 ng，且target DNA片段长度在300bp～3kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:sgRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。

2、60℃反应 30 min~1 h，85℃灭活 5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。

反式剪切实验

1、将以下组分加入到无核酸酶的微量离心管中：

注：反式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。AapCas12b Nuclease

可用1×Reaction Buffer 稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas Dilution Buffer，#30611），crRNA、Target RNA及ssRNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target RNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释，并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。

2、实时荧光定量 PCR仪检测荧光信号，60℃反应，每 30 sec采集一次荧光信号。

注意事项

1、 Cas12a的顺式剪切(cis-cleavage)：Cas12a在 sgRNA的引导下，特异性地剪切 target DNA。dsDNA靶标需带有 PAM位点，而 ssDNA靶标不依赖 PAM位点。

2、 Cas12a的反式剪切(trans-cleavage)：当 target DNA存在时，Cas12a/crRNA与 target DNA形成三元复合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同时，Cas12a被激发反式剪切活性，将反应体系中任意序列的单链 DNA切碎。

3、Cas12a蛋白对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，并在使用后立即将酶置于-20℃保存。