LAMP-CRISPR Cas13a DNA荧光检测试剂盒（一管法）

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产品简介

本试剂盒将环介导等温扩增技术（LAMP）与CRISPR/TccCas13a核酸酶组合，形成一种具有高灵敏度和特异性的核酸检测技术——OPTIMA-dx，解决了LAMP技术非特异扩增的短板。通过选择耐高温的TccCas13a核酸酶，实现了单管检测，避免了开盖引起的气溶胶污染和假阳性问题。当TccCas13a酶与crRNA、靶标RNA结合形成三元复合物后，其针对非特异序列单链RNA的反式剪切活性便会被激活，进而将体系中的荧光探针切碎释放荧光信号，荧光PCR仪或可检测到荧光信号，依据是否出现扩增曲线即可判断扩增阴阳性结果。试剂盒集成了OPTIMA-dx反应所需所有酶、dNTP、NTP和reporter荧光探针，只需加入引物和crRNA即可实现单管一步检测。

最低检出限

10~100 copies/test.

产品组成

需要但未提供的材料

qPCR仪、移液器、Nuclease-Free Water.

crRNA序列设计

5′–GUCACAACUCCCAUGUAGGCGGAGACUGCAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3′,（粗体区代表scaffold sequence结构序列，下划线区代表crRNA与特异靶标序列互补配对的spacer区，建议spacer区长度为20-28 nt)。 建议选用本公司的gRNA制备试剂盒（#30651）。

操作步骤

1、将以下组分加入到无核酸酶的微量离心管中：

2、实时荧光定量 PCR仪检测荧光信号（FAM通道），60℃反应1~2 h，每 1~2 min采集一次荧光信号。

核酸检测示意图

注意事项

1、    建议先通过常规LAMP筛选引物，再进一步在LAMP-CRISPR体系中进行验证。

2、    LAMP引物FIP或BIP其中一条需引入T7启动子序列，具体是在F2/F1或B2/B1之间引入“TAATACGACTCACTATAGGG”。

3、    Cas13a在 crRNA的引导下，特异性地剪切 target RNA，且对 target RNA的 PFS序列要求并不严格。

4、    Cas13a蛋白对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，并在使用后立即将酶置于-20℃保存。

5、    试剂盒灵敏度非常高，请扩增后不要打开反应管盖子，避免扩增产物形成气溶胶造成后续试验的假阳性结果。

6、    要达到最优检测效果，LAMP引物和crRNA的加入量需要进行优化。

参考文献

1.    Characterization of a thermostable Cas13 enzyme for one-pot detection of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2022; 119(28): e2118260119.

2.    Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 2017; 356(6336): 438-42.