DirectAmp Multiple Probe RT-qPCR SuperMix

本品利用在PCR体系中加入荧光探针 (TaqMan或Molecular Beacon等)，扩增过程中其荧光量与扩增产物量成正比，通过荧光量的检测测定样本核酸量。本品内含耐高温逆转录酶、双封闭热启动Taq DNA polymerase、RNase抑制剂、双阳离子缓冲液、dNTP、Mg²⁺和稳定剂。本产品为5×浓度，只需加入模板、引物、探针和水，使其工作浓度为1×即可反应。本产品适用于多重qPCR。

1）热裂解策略可实现RNA病毒核酸释放

将甲流病毒（H1N1）用灭菌PBS稀释成高中低三个浓度，不经核酸提取步骤直接用作PCR模板，使用亿目思科技DirectAmp Probe RT-qPCR SuperMix (Cat. 11172) 进行检测，分别设置两个反应程序，常规程序（50℃ 5min<逆转录>，95℃ 1min<预变性>，95℃ 5S，60℃ 30S<qPCR 40 circles>）和热裂解程序（90℃ 1min<热裂解>，50℃ 5min<逆转录>，95℃ 1min<预变性>，95℃ 5S，60℃ 30S<qPCR 40 circles>）。

从图中可以看出，在逆转录前增加热裂解步骤，qPCR Ct值可缩短3个以上，证明90℃ 1min可有效裂解甲流病毒释放出病毒核酸，提示本品可实现RNA病毒的免提取直扩反应。

2）极高的检测灵敏度

为进一步确认DirectAmp Probe RT-qPCR SuperMix热裂解免提取策略的灵敏度，对其最低检出限进行了测定。选用经数字PCR绝对定量的甲流病毒（H1N1）作为检测样本，分别选用两种一步法RT-qPCR产品：DirectAmp Probe RT-qPCR SuperMix和Probe RT-qPCR SuperMix（友商同类产品）。将甲流病毒溶液用灭菌PBS梯度稀释，DirectAmp直接用病毒溶液作为模板进行直扩反应，对照组则首先进行病毒核酸提取（QIAamp Viral RNA Mini Kit），然后将提取的RNA作为模板进行RT-qPCR反应。

从图中可以看出，DirectAmp免提取直扩方案对于高浓度样本，Ct值略高于对照组，分析原因应该是缺少核酸富集所致，但其最低可检到100 copies/mL的病毒溶液，而对照组只能检到1000 copies/mL，提示DirectAmp免提取直扩方案拥有更高的检测灵敏度。

3）针对低浓度样本更高的阳性检出率

取4个不同低浓度甲流病毒溶液作为模板，分别用DirectAmp Probe RT-qPCR SuperMix热裂解免提取和常规核酸提取+RT-qPCR两种方案进行检测，每个浓度样本重复50次。从图中可以看出，DirectAmp免提取直扩方案针对低浓度样本的检出率显著高于常规核酸提取方案，尤其是极低浓度样本（100 copies/mL）热裂解免提取检出率是常规核酸提取方案的2.5倍，分析其原因应该是极低浓度样本的核酸提取回收率不高所致，提示DirectAmp Probe RT-qPCR SuperMix拥有良好的阳性检出率。