当全行业反转录酶产品的耐高温上限始终无法突破65℃时，亿目思科技率先发布全球首款可耐98℃高温的新一代反转录酶——SV M-MLV，彻底突破反转录酶热稳定瓶颈，将RNA操作提升到一个新台阶。
1. 产品简介
反转录酶是负责RNA病毒基因组复制的酶，具有依赖于RNA的DNA聚合酶活性。来自小鼠白血病病毒(M-MLV)的反转录酶因具有高催化活性和保真度而被广泛用于RNA相关的研究和临床诊断。为减少反转录时RNA的二级结构和非特异引物结合，需要提升反转录反应温度，然而M-MLV反转录酶热稳定性欠佳，超过50度其活性会迅速下降。因此，提高反转录酶的热稳定性一直是提高其合成效率的重要研究目标。国内外研究机构开发了多款具有较好热稳定性的反转录酶，将M-MLV反转录酶反应温度由最初37℃逐步提升至55℃，然而其耐温上限始终无法突破65℃。
亿目思科技运用自主开发的蛋白酶定向进化平台，结合酶结构计算AI大模型可实现蛋白酶在实验室内高效定向分子进化，达到自然界需数亿年才能完成的蛋白进化进程，从而获得有价值的新型工具酶。通过在该技术平台的持续定向进化，亿目思科技获得了可耐98℃高温的新型反转录酶——SV M-MLV，其在98℃ 10min活性降低小于10%，90℃ 10min活性降低小于5%。SV M-MLV热稳定性远超业内同类产品，彻底打破了多年难以攻克的反转录酶热稳定性差技术瓶颈，使得RNA操作进入一个新纪元。
图1 M-MLV反转录酶分子结构图
2. 产品性能
1）热稳定性评价
将SV M-MLV分别在不同温度（80, 90, 95, 98℃）热处理10min或1min，然后与Taq配合进行一步法RT-qPCR，同时选择两款商业反转录酶SuperScript III M-MLV反转录酶（ThermoFisher，货号为18080044）和Induro M-MLV反转录酶（NEB，货号为M0681L）作为对照。结果显示，与未进行热处理对照组相比，80℃处理10min Ct值未发生变化，90℃处理10min Ct值仅下降1，95℃和98℃处理10min Ct值下降均＜2；热处理1min的所有组Ct值下降均＜0.5。形成鲜明对比的是两款商业反转录酶热处理后均完全失活。结果证明SV M-MLV具有良好的热稳定性。
图2 不同温度处理后RT-qPCR结果
2）检测灵敏度评价
将SV M-MLV与Taq配合进行一步法RT-qPCR，同时与三款商业反转录酶进行平行比较。选择3个不同浓度的RNA模板进行反应，结果显示SV M-MLV与商业反转录酶均能检测到1000拷贝/毫升浓度的RNA模板，证明SV M-MLV具有良好的检测灵敏度。
图3 不同浓度RNA模板RT-qPCR结果
3）反转录效率评价
提取HEK293细胞总RNA，利用SV M-MLV进行反转录获得cDNA，设计不同长度扩增产物的PCR引物，采用LA Taq进行PCR并对扩增产物进行琼脂糖电泳。结果显示0.5-15.1 kb均能有效扩增，证明SV M-MLV具有良好的反转录效率，对于长片段RNA也能有效反转录。
图3 不同长度RNA反转录效率
3. 产品应用场景
1）免核酸提取直扩
当前对于RNA样本的检测分为两步，分别是提取RNA和反转录/PCR，全部试验完成需要至少4 h以上，而RNA极易降解，过长的操作时间容易导致漏检。由于SV M-MLV和Taq酶均耐高温，而RNA病毒90℃ 1min即可完全裂解释放核酸。因此，对于RNA病毒的检测，可去除RNA提取步骤，将样本直接加入反应体系热裂解，然后启动反应，即在一管内完成样本核酸释放和核酸扩增。相比传统的核酸提取、扩增分步进行，基于SV M-MLV的单管直扩具有如下优势：
a) 提升检测效率：省去核酸提取步骤，可将整体检测时间缩短50%；
b) 提升检出率：RNA极易降解，样本直接加入反应体系避免了RNA降解造成的假阴性；
c) 降低交叉污染：将核酸释放和扩增集合一管，可避免核酸提取环节的气溶胶污染。
2）实现短期室温条件运输存储
SV M-MLV不仅耐高温性能大幅提升，其室温存储时间也远超传统反转录酶。实验证明SV M-MLV室温避光放置2周活性无明显变化，因此更适用于不易冷链运输的核酸检测试剂。
3）更适用于冻干/风干试剂产品
传统反转录酶由于稳定性较差，制备冻干/风干试剂时易丢失活性，造成产品批间差较大。而SV M-MLV良好的稳定性使其更适用于冻干/风干试剂的生产，确保酶活不丢失，产品批间差小。
