1、目的及适用范围
利用Ni2 鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。
2、主要仪器
Ni柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机
3、主要试剂
3.1磷酸盐体系
Binding buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM imidazole，pH 8.0；
Wash Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM imidazole，pH 8.0；
Elute Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，500 mM imidazole，pH 8.0。
3.2 Tris盐体系
Binding buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，20 mM imidazole，pH8.0；
Wash Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，60 mM imidazole，pH8.0；
Elution Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，500 mM imidazole，pH8.0；
Striping Buffer：20mM Tris，100mM EDTA，500mM NaCl，pH8.0。
酸性Buffer：20mM 醋酸钠，500mM NaCl，pH4.0。
Charge Buffer：0.1M NiSO4
4、操作步骤
4.1 Ni柱的预处理
4.1.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子；
4.1.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni；
4.1.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni；
4.1.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）；
4.1.5用5个柱体积的Binding Buffer平衡柱子。
4.2蛋白的纯化
4.2.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；
4.2.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；
4.2.3 将收集的菌体用Binding buffer重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；
4.2.4 将菌体用Binding buffer重悬，超声破碎菌体；
4.2.5 4℃，12000rpm，离心15min，收集超声后上清；
4.2.6 将收集的上清加入柱子中，4℃结合1-2h；
4.2.7 打开竹子底部帽子，流出穿透液；
4.2.8 用20-50个柱体积的Wash Buffer冲洗柱子，除去非特异性结合的杂蛋白；
4.2.9 用1-3个柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白；
4.2.10 将诱导前全菌，诱导后全菌，穿透，洗脱样品进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。
4.3 柱子的再生
4.3.1用2个柱体积的6M盐酸胍冲洗柱子；
4.3.2用5个柱体积的水冲洗柱子；
4.3.3 用3个柱体积的2%SDS冲洗柱子；
4.3.4 用1个柱体积的25%乙醇冲洗柱子；
4.3.5 用1个柱体积的50%乙醇冲洗柱子；
4.3.6 用1个柱体积的75%乙醇冲洗柱子；
4.3.7 用5个柱体积的100%乙醇冲洗柱子；
4.3.8 用1个柱体积的75%乙醇冲洗柱子；
4.3.9 用1个柱体积的50%乙醇冲洗柱子；
4.3.10 用1个柱体积的25%乙醇冲洗柱子；
4.3.11 用1个柱体积的水洗柱子；
4.3.12 用5个柱体积的100mM EDTA洗柱子,pH8.0；
4.3.13 用5个柱体积的水洗柱子；
4.3.14 用20%乙醇洗柱子, 并于4℃保存。
