Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程（编号：066）
1、目的及适用范围
利用Ni2 鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的包涵体重组蛋白。
2、主要仪器
超声破碎仪、冷冻离心机、Ni柱、垂直混匀仪
3、主要试剂
3.1 裂解Buffer：50mM Tris，5mM EDTA，0.8%NaCl，pH8.5
3.2 变性剂：6M盐酸胍，2mM EDTA， 50mM Tris，10mM DTT，pH8.5
3.3 Buffer B：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH8.0
3.4 Buffer C：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH6.3
3.5 Buffer D：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH5.9
3.6 Buffer E：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH4.5
4、相关的预处理
Ni柱的预处理：
4.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子；
4.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni；
4.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni；
4.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）；
4.5用5个柱体积的Buffer B平衡柱子。
5、操作步骤
5.1蛋白的纯化
5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；
5.1.2 4500rpm，离心10-15min，收集菌体；
5.1.3用裂解buffer重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；
5.1.4 将菌体用裂解buffer重悬，超声破碎菌体；
5.1.5 4℃，12000rpm离心15min，弃上清；
5.1.6 将沉淀用PBST洗涤，4℃，12000rpm离心10min，重复1次；
5.1.7 将沉淀用2M尿素洗涤，4℃，12000rpm离心10min，重复1次；
5.1.8 将沉淀用1M NaCl洗涤，4℃，12000rpm离心10min，重复1次；
5.1.9 将沉淀用变性剂重悬，浓度大约30-100mg/mL，室温或4℃混匀至沉淀逐渐溶解；
5.1.10 4℃，12000rpm离心15min，分离出上清，将上清以1:50稀释至Buffer B中，与挂好Ni的Beads结合1-2h；
5.1.11 流出穿透液；
5.1.12 10倍柱体积Buffer C洗涤杂蛋白；
5.1.13 3倍柱体积Buffer D洗脱目的蛋白。
5.1.14 3倍柱体积Buffer E洗脱目的蛋白。
5.1.15 将诱导前全菌，诱导后全菌，变性后蛋白，穿透，Buffer C洗，Buffer D洗，Buffer E洗样品用SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。
5.2 柱子的再生：同Ni柱亲和层析纯化poly-his可溶性重组蛋白
