1、目的及适用范围
该SOP用来规范测定流感病毒滴度的噬斑实验的标准操作。
2、主要仪器
细胞培养箱、安全柜、无酚红DMEM、TPCK 处理的胰酶 （2mg/mL 母液）PBS配置，过滤灭菌、低熔点琼脂糖 （3%浓度）PBS配置，高压灭菌，4℃保存、DMEM
4、操作步骤
4.1以1×105细胞接种12孔板，置于CO2孵箱培养过夜，使细胞长成单层（铺满80%以上）。
4.2用PBS洗涤12孔板内的MDCK细胞3次，吸净孔内的液体。
4.3取出-80℃冻存的wsn病毒液，融化后于4℃5000rmp离心5min。
4.4在1.5mL离心管中加入适量无血清无抗生素DMEM培养液。按照10倍梯度在离心管中逐级稀释病毒液（10-1-10-8）。
4.5将不同稀释度的病毒液加入12孔板，每个稀释度3个平行孔，每孔1mL，留一个孔做正常细胞对照。置于37℃孵箱孵育1h。
4.6吸弃病毒液，将12孔板用PBS洗3次。尽量去除残余的液体。
4.7在水浴锅中加热融化3%低熔点琼脂糖。待其冷却到50℃左右时，与37℃预热的无酚红DMEM培养液以1:1比例混合（DMEM中含有4μg/mL胰酶，即终浓度为2μg/mL），混匀后迅速加到12孔板中，每孔1mL。
4.8将12孔板在4℃放置10~15min，待琼脂糖凝固后再将12孔板翻转过来倒置37℃培养。在显微镜下观察细胞病变情况。培养2-4d后，将12孔板从孵箱中取出，对着光线计数空斑数。
5、注意事项
在铺琼脂糖时，注意琼脂糖温度不要过高，以免烫伤细胞和病毒。琼脂糖密度不宜过高或者过低。过高对流感病毒噬斑形成有一定影响；过低则不容易凝结，对后期的观察也会造成不便。
