1、目的及适用范围
该SOP用于规范体外水平检测蛋白-蛋白的相互作用的操作。
2、主要仪器及试剂
超声破碎仪、垂直混匀仪、离心机、Glutathione Sepharose 4B beads、PBS、PBST（根据实验调整triton-100的浓度）
3、操作步骤
3.1蛋白的诱导表达
3.1.1挑表达菌的单菌落至相应抗性的2mL LB液体培养基中，220 rpm 37℃摇菌过夜。同时摇空载体(例如pGEX-6p-1、pGEX-4T-2)的表达菌作对照。
3.1.2第二天，将摇好的1mL菌液接至相应抗性的100mL LB液体培养基中，220rpm 37℃摇菌至OD600值0.6～0.8之间时，加入终浓度为0.5mM IPTG诱导，220rpm 16℃诱导10～12 h。诱导前摇菌至OD600值0.6-0.8时，取出1 mL菌液室温12000 rpm离心，去除培养液将离心下的菌冻于-80℃保存，作为未诱导样品，按常规方法制备SDS-PAGE蛋白样品。
3.1.3第三天收菌，50 mL 离心管4℃ 5000 rpm离心10 min去除培养液，离心下的菌悬于10mL PBS (1mM DTT,1mM PMSF,1%Triton X-100)中（取出1mL作为诱导后的全菌样品，按常规方法制备SDS-PAGE蛋白样品），Φ6探头超声，超声时间2s，间隔时间5s，大约超声10 min。
3.1.4 4℃ 12000 rpm离心20 min, 上清使用一次性滤器（根据目的蛋白的分子量选择滤膜孔径直径）过滤至另一管中，准备过亲和层析Glutathione Sepharose 4B。如果不立即过亲和层析柱可将样品保存于-80℃。
3.2 GST Pull-down
3.2.1 Poly-Prep 层析柱中加入100μL Glutathione Sepharose 4B，用PBS洗beads三次，每次1ml。加入带GST标签的蛋白上清，约用100 mLPBS清洗杂蛋白。将已经结合上GST标签蛋白的Glutathione Sepharose 4B跑SDS-PAGE，测定GST融合蛋白的含量。
3.2.2 取结合到Glutathione Sepharose 4B的1-10μg GST融合蛋白和单独的GST 分别加入另一个带其他标签的蛋白上清（蛋白含量为1-10μg），4℃垂直混匀仪上结合2 h后约用100 mL PBST清洗杂蛋白。
3.2.3 将加入两种蛋白的Glutathione Sepharose 4B按常规方法制备SDS-PAGE蛋白样品。
3.3 Western- Blot Protocol检测
4、注意事项
根据两种蛋白结合力的强弱来调整加入蛋白的量。根据蛋白的性质决定结合的条件（温度、时间）。
