1、目的及适用范围
该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。
2、主要仪器及试剂
电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿
3、操作步骤
3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。
3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。
3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。
3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。
3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。
3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。
3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL的链霉素培养。划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬， 4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。分装20μL/管，-80℃冻存。
3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。提取质粒DNA。推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。
3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL体系。电泳检测酶切是否完全。
3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。
3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。
3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。电击完成后加入预热的LB培养基，37度摇床培养30～45min后涂kana平板。每个样品涂2～3个板。37℃倒置培养16～20h，尽量挑取小的克隆，每个样品挑10～20个克隆。培养不能超过24h；电转化体系不能含有盐离子。
3.8 碱裂解法提取重组腺病毒质粒，0.7%琼脂糖凝胶电泳。PacI酶切鉴定重组腺病毒质粒，PCR鉴定GOI的存在。由于同源重组可能发生在穿梭载体和Adeasy-1的ori区域（30K 4.5k），也可能发生在两个同源左臂(30k 3k)两种情况都为阳性。
3.9 质粒转化到非重组性感受态细胞（DH5a/top10），用商品化试剂盒提取质粒。
3.10腺病毒的包装
3.10.1提取转染用质粒。PacI酶切线性化重组腺病毒质粒。转染一个6cm培养皿细胞需要3μg质粒。保证线性化完全。乙醇沉淀法回收线性化的质粒。用20μL灭菌水重悬。
3.10.2在转染前传代293A细胞。传代后24h内转染，保证其转染时细胞覆盖率达到50%～70%。不能在传代24h后转染，无论细胞覆盖率多少。
3.10.3按照转染试剂说明书操作，转染293A细胞。转染前换无血清培养基。质粒3μg转染试剂(lipofectamine 2000)15μL培养基混合15～30min。加入到293A细胞培养皿混匀。4～6h后换完全的新鲜培养基。37℃培养箱5%CO2培养14～20d。观察CPE。如果穿梭载体是pAdTrack系列的，可以观察GFP的表达，推测转染效率和病毒滴度。不能在10天内收获转染的细胞，包装的腺病毒滴度太低。
3.10.4吹悬细胞，转入离心管中，500rpm离心10min，用1mLPBS重悬，-80℃冻37℃水浴融化，反复3～4次。离心，弃细胞渣。
3.11重组腺病毒扩增：用50%的第一代腺病毒接种293A细胞，2-3d出现细胞圆缩脱落时，收获细胞，离心弃上清，PBS 3mL重悬，冻-80℃，如此重复3-5次可得到高滴度的重组腺病毒。
腺病毒的表达蛋白的检测：可以根据表达蛋白的生物学性质或特异性抗体检测。
