1、目的及适用范围
该SOP快速将重组线性化载体整合到酵母基因组中，以实现目的基因在酵母中的表达。
2、主要仪器及试剂
试管、摇床、50mL离心管、250mL三角摇瓶、0.2cm电转化杯、电转化仪、低温离心机、1.5mL离心管、移液器、YPD培养基、无菌水、1mol D-山梨醇
3、操作步骤
3.1 菌体的准备
3.1.1挑取酵母单菌落，接种至含有5mL YPD培养基的试管中，30℃、250~300r/min培养过夜；
3.1.2取100~500?L的培养物接种至含有100mL新鲜YPD培养基的250mL三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；
3.1.3将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用50mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
3.1.4按步骤3.1.3离心，用50mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
3.1.5按步骤3.1.3离心，用20mL的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
3.1.6用灭菌冰冷的1mol的山梨醇轻轻重悬细胞并使细胞终浓度达到OD600=100，即得到感受态细胞。该感受态细胞应储存于4℃中，当天5h内使用。备注：可将其分装为80?L一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。
3.2 电击转化
3.2.1将5~10?g的线性化DNA溶解在5~10?L 无菌去离子水中，与80?L的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电转化杯预先用70%乙醇清洗浸泡，并置于紫外灯下消毒半小时；
3.2.2将电转化杯冰浴5min；
3.2.3根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；
3.2.4电击完毕后，加入1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL的离心管中，30℃温浴1～2h；
3.2.5将菌体悬液涂布于含100?g/mL Zeocin的YPDS平板上，每200~600?L涂布一块平板；
3.2.6将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。
电压1.5kV；电容25?F；电阻200Ω。电击时间为4～10ms。
4、注意事项
4.1制备感受态的菌液收集时间
4.1.1准确测定OD值：OD在1.3～1.5之间。为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确。OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10mL。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
4.1.2 75mL的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50mL离心管里所剩菌体特别浓，需要1mL 山梨醇才可溶解为糊状。
4.2 制备感受态的菌液量，如果只转一个样品，一般50mL的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
4.3感受态的保存：感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80μL 离心管分装，-70～-80℃保存。
4.3感受态做好后，最后一次吸出山梨醇时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
4.4 最后用毛细管取出100μL出来，加入质粒，混匀。
4.5 电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4.6 电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30℃静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
4.7 电击之后，加入1mL的山梨醇，吸入1.5mL的离心管中，置于30℃摇床低速培养1h，再涂板。
4.8 转化后1mL用山梨醇重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。
附：
1、YPD的配制方法
1.1溶解10gYE, 20gPEP于900mL水中，如制平板加入20g琼脂粉
1.2高压20min
1.3加入100mL 10×D
2、1M/L的D-山梨醇配制方法
186g山离醇，加水至1L，高压20min，4℃放置
