1、目的及适用范围
该SOP用来规范ELISPOT测定小鼠IFN-γ水平的操作。
2、主要仪器及试剂
CO2细胞培养箱、普通光学显微镜、超净工作台（生物安全级别）、电动吸引器、移液器、细胞计数器、微量移液器及配套枪头、通道微量移液器、0.5mL离心管、1.5mL离心管、RPIM-1640培养基、淋巴细胞分离液、Quick Spot 小鼠 ELISPOT 预包被试剂盒
3、相关器皿的预处理
玻璃制品和金属制品高压灭菌
4、操作步骤
4.1 分离小鼠脾细胞
4.1.1断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2min。
4.1.2在超净台中用大头针固定，小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。
4.1.3 在60mm培养皿中放入4-5mL淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上。然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。
4.1.4 把悬有脾脏细胞的分离液转移到离心管中，然后覆盖上大约1mL的1640培养基。
4.1.5 800g离心30min。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集
4.1.6 吸出淋巴细胞层，加入10mL 1640培养基洗涤一次，250g离心10min。倾倒上清液，加入3-5mL 含5S的1640培养基重悬，细胞计数。
4.2参考达科为生物技术有限公司的Quick Spot 小鼠 ELISPOT 预包被试剂盒产品说明书进行，具体如下：
4.2.1 第一天：接种细胞，加入刺激物，培养（严格注意无菌操作）。整个实验设置一组正对照（ConA 或者其他非特异性刺激物），每一个细胞样品（同一个捐献者或者实验动物）要设一个负对照（不加刺激物），整块板还要加一个背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）。
4.2.2 填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4 个孔的重复（想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4个孔的重复）。
4.2.3 预包被板在使用前需要活化。具体操作：加入200μL的RPMI-1640培养基或者Lympho-Spot?无血清培养基，室温静置10min左右，倾倒。
4.2.4 按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100μL/孔。细胞在孔中的分布要尽量均匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT 板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反）。正对照的细胞浓度为1×105细胞数/孔，实验组的样品细胞浓度请自行调整。
4.2.5 加入100μL的1640（5S）培养基到背景负对照孔。
4.2.6 正对照每孔加入10μLConA，终浓度2-20μg/mL。
4.2.7 加入实验者自己的刺激物（用RPMI1640 配制成10×终浓度，10μL/孔）到实验孔。加完刺激物之后，不要再拍击ELISPOT板。
4.2.8 当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入37°C，5％CO2培养箱培养16-36h。注意：碰撞会引起细胞移位，造成斑点模糊、拖尾。在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板，并尽量减少开关培养箱的次数。
4.2.9 第二天：培养后操作，倾倒孔内的细胞及培养基。
4.2.10 裂解细胞：每孔加入200μL冰冷的去离子水，4℃冰箱冰浴10min（低渗法裂解细胞）。
注意：切不可将加了去离子水的板子放入-20°C 冰箱。一旦结冰，将会损害膜上的包被抗体与细胞因子，导致最终显色的斑点暗淡偏小甚至实验的彻底失败。
4.2.11 洗板：每孔用200μL1×Washing buffer 洗涤5-7 次，每次30s。最后一次，在吸水纸上扣干。
4.2.12 检测抗体孵育：每孔加入100μL稀释好的生物素标记的抗体，37°C 孵育1h。
4.2.13 洗板：每孔用200μL1×Washing buffer 洗涤5 次，每次30s。最后一次，在吸水纸上扣干。
4.2.14 亲和素孵育：每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，37°C 孵育1h。
4.2.15 洗板：每孔用200μL1×Washing buffer 洗涤5次，每次30s。最后一次，在吸水纸上扣干。
4.2.16 显色：照试剂配制说明，配好AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温避光静置15-45min（在20 -25°C，显色25min较合适）。注意：如果室温低于20°C，需要在37°C 孵箱做显色，每隔5-10 分钟检查一次。
4.2.17 待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。
4.2.18 ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。
5、问题向导
5.1 提取外周血淋巴细胞时，有那些注意事项？如果取外周血淋巴细胞 (PBMC) 进行ELISPOT检测，最好采用新鲜血液。在保证无菌操作的前提下，首先应保证取血时抗凝剂应及时充分的与血液混匀，避免血凝块的出现。抗凝血最好及时提取PBMC，避免放置时间过长，室温下避免过夜。应选用分离效果好的淋巴细胞分离液，避免PBMC中混有过多其他细胞成分或杂质。
5.2 在分离外周血淋巴细胞时，发生了溶血，会影响我的试验结果吗？外周血出现溶血后，在使用淋巴细胞分离液分离PBMC时，溶血产生的细胞碎片、血红素等杂质将极大可能悬浮于分离液的层面，在吸取PBMC时非常容易混入这些杂质，由于混入细胞的细胞碎片和血红素很难清洗去除，在进行ELISPOT实验时，有可能沉积在培养板底，严重影响细胞因子和抗体的结合，进而影响实验结果。
5.3 采用什么方法分离外周血淋巴细胞适合于ELISPOT试验？使用专业的淋巴细胞分离液。国产的如：达科为公司生产的EZ-SepTM Human 9×（分离人PBMC）、EZ-SepTM Monkey 9×（分离猴的PBMC）、EZ-SepTM Mouse 1×（也可用来分离大鼠/兔子等的外周血淋巴细胞）；进口的如：Optiprep、Lymphoprep等。
5.4 从动物脾脏组织分离淋巴细胞应如何操作？取动物脾脏组织时，应注意取材的无菌操作。分离出脾脏组织，研磨后过200目筛网，保证所分离的细胞为单个细胞悬液。获得细胞悬液后应该使用相应的淋巴细胞分离液进一步分离单个核细胞。
5.5 在ELISPOT板上，每孔应该放置多少数目的淋巴细胞？在使用ConA，PHA等阳性刺激孔中，一般放置的淋巴细胞数为 104～2×105。在使用抗原作为刺激剂的情况下，每孔细胞浓度可在1～4×105。在使用多克隆刺激剂的情况下，应适当调低细胞浓度。但由于所用刺激剂的强度和批号不同，建议初次进行ELISPOT检测时，对刺激剂浓度和细胞浓度设立梯度，以保证较理想的实验结果。
5.6 对淋巴细胞进行：体外刺激预孵育、或板内同步刺激培养应如何操作？将抗原和淋巴细胞在体外混合，刺激并预孵育，是通用的方法。预孵育的淋巴细胞，在置入ELISPOT板之前应使用复温到37℃的培养液清洗细胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培养5～6h。对于高度特异性抗原，可以采用将淋巴细胞和抗原同时加入ELISPOT板孔中，37℃培养箱中，同步进行刺激、培养、和细胞因子捕获。淋巴细胞板内同步刺激培养的时间通常为22～24h。
5.7 在ELISPOT实验中刺激物应如何选择？常用的非特异性刺激物有PMA/inomycin、PHA、Con A。根据具体的实验选择上稍有稍有不同，一般而言：刺激小鼠细胞用Con A或者PMA/inomycin，刺激人 PBMC多用PHA。特异性的刺激物主要有CEF、ICE（只能用于人）等多肽或者蛋白。
5.8 在使用抗原刺激淋巴细胞培养过程中，我发现培养液变黄，有什么影响？这种现象通常见于使用很强的多克隆抗原刺激淋巴细胞，某些多克隆抗原会导致淋巴细胞凋亡或者死亡，大量淋巴细胞死亡后使培养液变黄。使用这些淋巴细胞进行后续ELISPOT试验通常得到很低的斑点（SPOT）形成。换用特异性抗原后可以避免该现象。
5.9 在ELISPOT结果中出现：不规则的大块斑点，有的区域没有斑点是什么原因？不规则斑点区域的出现一般是细胞分离不完全所至，有时候采用多克隆抗原孵育的淋巴细胞也会产生成团现象。请确认加入到ELISPOT板中进行孵育的是单细胞悬液。
5.10 关于培养基的选择问题 推荐使用无血清培养基（注意：是指专业的完全培养基，不是不含血清的1640等基本培养基）如国产的达科为公司的生产的Lympho-SpotTM 无血清培养基、进口的荷兰U-Cytech公司生产的Lympho-SpotTM serum free medium等。当然也可以根据实际情况选用自备的1640培养基（含5%血清），但是血清带来的干扰无法排除。
