1、目的及适用范围
该SOP用来规范细胞冻存及复苏的操作。
2、细胞的冻存
2.1主要仪器
液氮灌、微量移液器、超低温冰箱、细胞冻存管（2mL）
2.2 试剂及配置方法
2.2.1细胞冻存液：
DMSO 1mL（0.5mL）
小牛血清 2mL（1mL）
培养液 7mL（3.5mL）
总体积 10mL（5mL）
2.2.2胰酶：0.025%胰酶（100mL超纯水中加入0.025g胰酶） 1mM EDTA
2.2.3 DMEM培养基
2.2.4 10%胎牛血清
2.3 操作步骤
2.3.1选对数生长期细胞，收集细胞24h前换液一次。
2.3.2配制细胞冻存液。
2.3.3用胰酶消化以把细胞制成细胞悬液。
2.3.4 800-1000rpm，10min，弃上清。
2.3.5将冻存液4.5mL逐滴加入离心管，吸管吹打令细胞重悬。
2.3.6向每个冻存管中加入细胞悬液1.5mL。
2.3.7封严瓶口，标明细胞名称和冻存日期。
2.3.8将冻存管置4℃ 0.5h，-20℃ 1h，-80℃过夜，然后转至液氮罐中长期保存。
3、细胞的复苏
3.1主要仪器及试剂
37℃水浴锅、培养皿、CO2细胞培养箱、DMEM培养基（10%胎牛血清）
3.2 操作步骤
3.2.1将冻存的细胞从液氮罐中取出。
3.2.2迅速放入37℃水浴锅中，并不时摇动，使其尽快解冻（1-2min）。
3.2.3解冻后，800rpm离心5min。
3.2.4在离心期间，取出一细胞培养皿，向皿中加入预热的培养基。
3.2.5离心完毕后，取出冻存管，小心吸掉上清，并向管中加入1mL培养基（从皿中吸取即可），反复轻轻吹打以使细胞充分悬浮。
3.2.6将吹打混匀的细胞吸入皿中，摇匀后放入CO2细胞培养箱中培养。
4、注意事项
4.1要选择生长状态较好的细胞进行冻存，冻存时务必标清细胞名称以及冻存时间。
4.2细胞复苏时，一般将一支冻存管中的细胞首先复苏至6cm皿中，以保证足够的细胞密度；第二天需换液，以保证充足营养；当细胞长满传代时，首先将6cm皿中的细胞传入一个10cm皿中，当下次传代时即可按照一般方法传代。
4.3 细胞复苏后一般传至三代以上方可试验。
