1、目的及适用范围
该SOP用来规范提取纯化细胞和组织膜蛋白的操作。
2、主要仪器
均质仪、冷冻台式离心机、冷冻超速离心机、微量移液器
3、试剂及配制方法
3.1 Buffer A：0.32M 蔗糖、5mM Tris-HCl(pH 7.5)、120mM KCl、1mM EDTA、0.2mM PMSF、1μg/mL Leupepmin、1μg/mL PepstatinA、1μg/mL Aprotinin 冰上预冷。
3.2 Buffer B：20mM HEPES(Ph 7.5)、10% 甘油、2% TritonX-100、1mM EDTA、0.2mM PMSF、1μg/mL Leupeptin、1μg/mL PepstatinA、1μg/mL Aprotinin 冰上预冷。
3.3 Buffer C：0.1M Na2PHO4、0.02M EDTA(pH7.4)
3.4 PMSF：用异丙醇溶解成17.4 mg/mL的贮存液(100mmol/L)，分装成小份贮存于-20℃。
3.5 Leupeptin：2mg溶于400μL水中，-20℃可保存半年。
3.6 Pepstatin A：5mg溶于5mL 乙醇中，并加入250μL冰醋酸后分装，-20℃可保存半年。
3.7 Aprotitin：2mg溶于200μL水中，分装成50μL每管，保存于-20℃。
4、相关器皿的预处理
剪刀和均质仪的转头需彻底清洗后高压灭菌。
5、操作步骤
5.1 在冰冷的匀浆缓冲液(Buffer C)中切碎组织块，倒出血水。用Buffer C漂洗组织碎块，并置于冰上，重复上述操作，直至组织碎成1mm3大小的碎片，且无可见的血水。
5.2 收集消化后细胞，用Buffer C冲洗2遍，1000rpm离心，获得细胞团。
5.3取组织或细胞2g，加入5mL Buffer A于冰上充分匀浆。
5.4匀浆液在4℃，600g离心10min，上清含有细胞膜，线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃去沉淀。
5.5上清在4℃，8000g离心10min，沉淀线粒体，弃去沉淀。
5.6取上清液在4℃下，100000g离心1h。
5.7将沉淀重悬在3mL Buffer C中，加在准备好的梯度离心管的最上层(梯度为40%，36%和32%（重量/体积）PBS溶解的蔗糖溶液，室温平衡1-2h)，在4℃下，100000g离心1h。
5.8小心吸取上层32%的蔗糖缓冲液，并以PBS稀释，然后在100000g离心1h。
5.9弃去上清(如有需要可以重复步骤5.8)，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2h后分装至离心管中，4℃下，10000rpm离心30min。
5.10收集所有上清液即为膜组分。
5.11样品膜组分可于干冰/乙醇中速冻，保存于-80℃。
6、问题向导
6.1无法检测到提取的膜蛋白
可能原因：
*在操作过程中蛋白降解，提取膜蛋白的全程操作都应在低温下进行，其中匀浆步骤尤其注意防止过热。
*蛋白浓度低，可以将最后收集的上清液浓缩后再检测。
7、注意事项
全部操作都应在冰上或四度进行。PMSF有剧毒，应在通风橱中操作。
