1、目的及适用范围
该SOP用来规范人肝组织冰冻切片免疫组化染色的操作。
2、主要仪器
恒温培养箱、普通生物显微镜
3、试剂及配制方法
3.1 0.3% H2O2 甲醇作为母液配制
3.2 5％BSA 以PBS为母液配制
3.3 苏木精染料：4mL蒸馏水（PH7.0） 1mL过滤苏木精
3.4 PV-9000试剂
3.5 AEC显色剂
3.6 PBS pH7.4
3.7 中性封片剂
4、操作步骤
4.1 将冷冻切片用蒸馏水冲洗2次。3min/次。如果是石蜡切片需要经过脱蜡过程。
4.2 加入0.3% H2O2室温孵育20min，以消除内源性过氧化物酶的活性。
4.3 自来水冲洗3次后再用蒸馏水冲洗3次。用PBS浸泡3min，弃去，重复三次。
4.4 5％BSA封闭，室温孵育15-20min。甩掉即可。
4.5 滴加1:100稀释的RRP抗体和阴性兔血清，4℃过夜。
4.6 PBS浸泡3min，重复3次。
4.7 滴加PV-9000试剂I聚合物辅助剂，37℃孵育20min；PBS浸泡3min，重复3次。
4.8 滴加辣根酶标记二抗（试剂II），37℃孵育20min； PBS浸泡3min，重复3次。
4.9 AEC显色剂显色，在小试管中加1mL蒸馏水，按照顺序分别加入试剂1、2、3各50μL（1滴），混匀，即为1mL的AEC显色液。配制好的溶液应避光保存，30min内有效。该底物与过氧化物酶反应生成红色不溶物。室温下染色时间约5-8min，可以在显微镜下根据颜色的变化掌握染色时间。必要时可延长至30min。蒸馏水充分冲洗。
4.10苏木精复染2min，自来水冲洗后蒸馏水冲洗；37℃烤片干燥过夜。
4.11切片从37℃取出，放置于室温封片。
5、注意事项
如果为石蜡切片，在制作过程中对组织内抗原暴露有一定的影响，封闭前进行抗原修复。苏木精染料应每次新鲜配制。
