1、目的及适用范围
该SOP用来规范FITC标记抗体的操作
2、主要仪器
磁力搅拌器、分光光度计
3、试剂及配置方法
3.1 交联缓冲液：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L
3.2 PBS：pH7.2-7.4
3.3 FITC：将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光
3.4 终止液：5mol/L的NH4Cl
4、操作步骤
4.1 4 ℃下将待交联的蛋白（浓度?1mg/mL）在交联反应液中透析三次4 ℃，至pH值为9.0。
4.2 以P:F（蛋白质：FITC）为1mg:150μg 的比例，将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 h。
4.3 加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4 ℃终止反应2 h。
4.4 将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
4.5 交联物的鉴定
蛋白浓度(mg/mL) = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4
F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ]，该值应介于2.5～6.5之间。
4.6 FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃暗处保存。
5、问题向导
5.1 F/P值超过6.5
可能原因
*交联物在PBS中透析时间不够，FITC冗余。应该增加透析时间和换液次数。
5.2 F/P值小于2.5
可能原因：
*交联的蛋白未结合足够量的FITC。可以增加交联的FITC量以及交联时间。
6、注意事项
在不发生沉淀的前提下，初始蛋白浓度应尽量高。在交联前蛋白浓度最好超过1mg/mL。
