1、软件使用
1.1 推荐软件：Primer Premier 5.0
1.2 优点：操作简单、显示各种参数改变和二聚体、异二聚体、发夹结构等。
1.3 本地同类软件：DNAClub；Oligo 6.22；Vector NTI Suit；Dnasis；Omiga；Dnastar；DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)。
1.4 网上同类软件：Primer3、JaMBW（European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg 开发）。http://210.72.11.60网站已引进并调试好这两种软件。
2、推荐操作
引物搜索：Primer Premier 5.0、引物评价：Oligo 6.22
3、引物设计的原则
首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：
3.1 引物的长度一般为18-25bp，引物长度过长会导致延伸温度过高， 从而影响DNA聚合酶的效率，上下游引物长度差别最好不要大于3bp。
3.2 引物最好在模板DNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。可在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
3.3 引物3′端不能选择A，最好选择T。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
3.4 引物的GC含量一般为40-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。Tm值以接近72℃为宜，上下游引物Tm值同样不应相差过大。
3.5 引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
3.6 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值）。
3.7 碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’ 端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
3.8 Frq曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用Frq 值相对较低的片断。
3.9 以公式(4×G/C 2×A/T–5)计算Tm值，即退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度。4-6℃的差别似乎对PCR产量影响不大，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃。
3.10 DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。
3.11 向引物的5’端添加限制性酶切位点，因为位于DNA分子5’端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以，引物应当超出内切酶识别位点至少3个核苷酸。引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
4、引物设计注意事项
4.1 对特异性的标准掌握更严格一些，也比普通PCR引物设计时更优先考虑特异性。
4.2 Tm值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR的热循环程序。选用Tm值稍高一些，甚至退火温度接近酶的最佳延伸温度的引物，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。
5、简并引物的设计
5.1 简并引物常用的几个方面：从已知蛋白到相关核酸分子的研究；用一组引物扩增一类分子。
5.2 注意事项
5.2.1 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区。如蛋氨酸和色氨酸均只有一个密码子。
5.2.2 充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。
5.2.3 引物不要终止于简并碱基，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。
5.2.4 在简并度高的位置，可用次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。
5.2.5 以上几点，遵循的总的原则为：尽量降低引物的简并度，尤其在3’末端或近3’末端。
5.2.6 用一对简并引物扩增一类DNA分子时，同样遵循上述总的原则，即尽量降低引物的简并度，尤其在3’末端或近3’末端。 在此种应用中，应先利用工具软件（多序列对准比较软件）或其它工具找到这些分子的保守区，然后根据共有序列，应用上面所述的一些原则来设计所需要的引物。
