1. 目的及适用范围
以DNA的半保留复制机理为基础，利用温度控制DNA的变性与复性，通过添加引物，DNA聚合酶，dNTP等完成特定基因的体外复制，已被广泛用于特定基因的体外扩增，是分子生物学研究的最重要技术之一。
2. 主要仪器
PCR仪，掌型离心机
3. 试剂
DNA聚合酶、dNTP混合物、10×聚合酶Buffer、去离子水
4. 操作步骤
4.1在无菌的0.2mL离心管中按下列顺序加入试剂：
反应物用量
10×聚合酶Buffer5μL
dNTP混合物各200nM
上游引物10-100pM
下游引物10-100pM
模板DNA0.1-2μg
DNA聚合酶2.5U
总体积（μL）加水至50μL
4.2 将混合物振荡混匀，于掌型离心机上轻微离心。
4.3 将反应管置于基因扩增仪模块中，按以下顺序开始扩增：
4.3.1 热变性 94 ℃ 5min
4.3.2 变性 94 ℃ 1min
4.3.3 退火 温度及时间根据具体实验设定
4.3.4 延伸 温度及时间根据具体实验设定
4.3.5 步骤4.3.2至步骤4.3.4循环进行，共29个循环
4.3.6 延伸 72 ℃ 10min
4.3.7 冷却 4℃
5. 问题向导
5.1 PCR产物的电泳检测时间
一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失而出现假阴性，不出现扩增条带。
5.2 PCR反应的关键环节有模板核酸的制备、引物的质量与特异性、酶的质量及PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，模板DNA中含有杂质蛋白或聚合酶抑制物如酚，乙醇等都会影响PCR反应效率。
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是影响PCR效率的主要因素。引物应高浓度小量分装保存。反应体系中每条引物的浓度控制在10～100pmol范围内，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
DNA聚合酶：DNA聚合酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
5.3 PCR循环条件：PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
5.3.1 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步骤若不能使靶基因模板完全变性，就会导致PCR失败。
5.3.2退火温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G C)＋2(A T)、复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
5.3.3延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子、70℃ 60核苷酸/S/酶分子、55℃ 24核苷酸/S/酶分子、高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
5.4 其它影响因素：
5.4.1 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL。或100μL，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。
5.4.2 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
5.4.3 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
5.5 假阳性的原因：
5.5.1 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
5.5.2 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
5.6 出现非特异性扩增带：
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：①引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。②Mg2 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。③酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶，减少dNTP的浓度，适当降低Mg2 浓度，增加模板量，减少循环次数。
