1. 目的
该SOP是利用抗原抗体特异性结合的原理，将待检抗体/抗原和酶标抗原/抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原/抗体起反应。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，利用颜色反应放大反应效果从而定性或定量分析，从而使测定方法达到很高的敏感度。
2. 适用范围
该SOP适用于测定抗原抗体的匹配程度，血清中的抗体滴度，利用已知抗体判定未知蛋白的生物学特性等。
3. 主要仪器
酶标仪、洗板机、酶联条、微量移液器
4. 试剂
0.05 M pH 9.6碳酸盐缓冲液、0.15 M pH 7.4 PBST、稀释液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M柠檬酸、0.1 M EDTA、底物反应液A、底物反应液B、终止液（2 M H2SO4）
具体的制备步骤见附件。
5. 操作步骤
5.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）常规操作
5.1.1将重组蛋白用包被缓冲液按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释后，每孔加100μL，设两排平行孔和阴性对照孔，4℃过夜包被（12-18h）或37℃包被5h。
5.1.2 次日用封闭液 37℃封闭1h，PBST洗涤3次，每次2min。
5.1.3 加入100μL用稀释液1:1000稀释的一抗，37℃温育30min，再用PBST洗涤后，每次2min。
5.1.4 加入100μL 1:1000稀释的HRP标记的二抗兔抗马IgG，37℃温育15min，洗涤后分别加入ELISA显色A液和B液，各50μL，5min后再加入50μL终止液，最后测定其A450nm，以测定孔与阴性对照孔A450nm＞2.1判为阳性。
5.2 其他模式酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤
5.2.1双抗体夹心法
5.2.1.1将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。
5.2.1.2加入待检样品，使之与固相抗体充分接触，使得样品中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物，洗涤除去其他未结合的物质。
5.2.1.3 加入酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样品的量正相关。
5.2.1.4 加入底物，夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
5.2.2 双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。当样品中待测抗原浓度过高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。
5.2.3 间接法测抗体
5.2.3.1将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
5.2.3.2加入稀释的待检血清，其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤后固相载体上只留下特异性抗体。
5.2.3.3加入酶标抗抗体，与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
5.2.3.4加入底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体的量。
5.2.4 竞争法
5.2.4.1将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤。
5.2.4.2待测管中加入待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量，洗涤。
5.2.4.3加入底物显色，参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
5.2.5 捕获法测IgM抗体
5.2.5.1 将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM，洗涤。
5.2.5.2 加入稀释的血清标本，保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获，洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
5.2.5.3 加入特异性抗原试剂，它只与固相上的特异性IgM结合，洗涤。
5.2.5.4 加入针对特异性的酶标抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合，洗涤。
5.2.5.5 加入底物显色，如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
6. 注意事项
6.1封闭液每孔不能少于300μL，以充分封闭非特异性结合位点。
6.2 1×PBST洗涤次数不得少于3次，每次洗涤结束后应在吸水纸上拍干。
7. 问题向导
7.1 建立新的ELISA方法时，需重新用矩阵法确定最佳抗原包被浓度、最适封闭液、最佳一抗浓度，最佳二抗浓度等条件。
7.2 应用亲和素－生物素系统在ELISA中的应用时有多种形式。可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
附：
1. 包被缓冲液
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸馏水至 1000mL
溶解后每瓶50mL分装，高压灭菌备用。
2. 洗涤缓冲液
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
加蒸馏水至 1000ml
加热溶解后50mL分装，高压灭菌备用。用前加Tween-20至0.05％。
3. 稀释液
NaCl 2.1g
PEG6000 4g
加洗涤缓冲液至 100ml
4. 封闭液
BSA 3g
加洗涤缓冲液至 100mL
溶解后50mL分装，－20℃保存备用。
5. 0.2M Na2HPO4
Na2HPO4·12H2O 7.16g
加蒸馏水至 100mL
溶解后50mL分装，高压灭菌备用。
6. 0.1 M 柠檬酸
柠檬酸·H2O 2.10g
加蒸馏水至 100mL
溶解后50mL分装，高压灭菌备用。
7. 0.1 M EDTA
EDTA 3.72g
加蒸馏水至 100 mL
用NaOH 调pH值8.0，加热溶解后每瓶50mL分装，高压灭菌备用。
8. 底物反应液A
0.2M Na2HPO4 51.4 mL
0.1M柠檬酸 48.6 mL
30 % H2O2 67 ?L
用HCl调pH值5.0～5.4
9. 底物反应液B
TMB 50 mg
加无水乙醇（或DMSO） 5 mL
0.1M柠檬酸 5 mL
0.1M EDTA 0.5 mL
加蒸馏水至 100 mL
10. 终止液（2 M H2SO4）
蒸馏水178.3 mL，逐滴加入98％的浓硫酸21.7 mL
