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全面了解LAMP技术等温扩增技术中最烧脑的当属 LAMP 技术，今天就来一起全面了解一下 LAMP 技术吧。环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 是 Notomi 等人在 2000 年发表的一种核酸扩增技术 [1]。针对靶基因的 6 个区域设计 4-6 条特异性引物，在链置换 DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase) 作用下，可以在 60-65 ℃ 温度范围内进行等温扩增。LAMP 克服了传统 PCR 反应需要反复升降温获得单链模板的缺点，实现了等温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率，相较于 PCR 反应扩增原理更为复杂，但大大缩短了扩增时间，应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域。 Bst DNA 聚合酶 用于 LAMP 技术的酶是 Bst DNA 聚合酶，来自 Geobacillus stearothermophilus (BF) 的 DNA 聚合酶 I 的大片段，具有很强链置换活性，能让模板 DNA 双链的氢键发生解离，然后以一条链为模板合成新的 DNA 链。Bst DNA 聚合酶的最适温度为 65 °C，而 60-65 ℃ 是双链 DNA 复性及延伸的中间温度，DNA 在 65 ℃ 左右处于动态平衡状态，同时利用 Bst DNA 聚合酶本身的特性，使得 LAMP 技术可以在一个恒定的温度下完成扩增反应。Bst DNA 聚合酶具有 5’-3’DNA 聚合酶活性，持续合成能力较弱，无法进行长片段 DNA 扩增，因此 LAMP 扩增的靶基因长度最好在 300 bp 以内。目前，多种等温扩增技术都是基于Bst DNA 聚合酶的链置换活性，如 SDA、RCA 、LAMP、RAA 等，不同公司对野生型的 Bst DNA 聚合酶进行了探索和开发，商业酶具有更高的热稳定性和抗抑制能力。 LAMP引物设计 LAMP 的特点是使用 4 或 6 种不同的引物，专门设计用于识别靶基因的 6 个不同区域，包括 3’端的 F3c、F2c 和 F1c 区域和 5’端的 B1、B2 和 B3 区域。LAMP的特异性极高，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。
正向内引物（Forward Inner Primer，FIP）：由 F2 和 F1c 区域组成，F2 区域与靶基因 3’端的 F2c 区域互补，F1c 区域与靶基因 5’端的 F1c 区域序列相同。 正向外引物（Forward Outer Primer，F3）：由 F3 区域组成，与靶基因的 F3c 区域互补。 反向内引物（Backward Inner Primer，BIP）：由 B1c 和 B2 区域组成，B2 区域与靶基因 3’端的 B2c 区域互补，B1c 区域与靶基因 5’端的 B1c 区域序列相同。 反向外引物（Backward Outer Primer，B3）：由 B3 区域组成，与靶基因的 B3c 区域互补。 LAMP 的引物设计极其复杂，推荐使用 LAMP 专用的引物设计软件：PrimerExplorer (https://primerexplorer.jp/e/)。 LAMP反应原理 LAMP 反应可分为复制起始阶段和循环扩增阶段。LAMP 不同于 PCR，它不需要通过热变性来促进双链 DNA 转化为单链。 复制起始阶段 1. 正向内引物 FIP 的 3’端 F2 序列与靶 DNA 的 F2c 区域结合，引导合成 DNA。 2. 正向外引物 F3 比 FIP 短，缓慢地与模板中的 F3c 互补配对，并启动链置换 DNA 合成，置换出正向内引物 FIP引导的合成链。被置换出的 DNA 单链（片段 A）由于 5’端含有 F1c 和 F1 序列，可互补配对形成茎环结构。 3. 置换出来的单链 DNA 的 3’ 端 B2c 区域可与反向内引物 BIP 的 B2 序列结合引导合成 DNA。然后反向外引物 B3 与 3’端 B3c 互补配对，并置换出反向内引物 BIP 合成的 DNA 单链。最终被置换出来的 DNA 单链 5’端和 3’端均含有可自身互补配对成环的序列( B1c / B1 和 F1c / F1 )，可形成茎环结构（片段 B）。
循环扩增阶段 随后，茎环结构（片段B）用作 LAMP 反应第二阶段的起始材料，通过连续链置换进入循环扩增阶段。 4. 片段 B 的 3’端形成环状结构后，可以以自身序列为模板引导合成 DNA 链。同时 3’端环状部分的 F2c 区域为单链状态，可与正向内引物 FIP 的 F2 序列结合引导 DNA 合成。 5. 此时，合成的 DNA 单链 3’端含有 B1/B1c 序列可再次互补配对成环，并且 3’端又可以自身序列为模板引导合成 DNA 链，同时置换出前面合成的 DNA 链。 6. 新合成的 DNA 链和置换出来的 DNA 链 3’端均含有可互补配对成环 B1/B1c 序列，3’端环状部分的 B2c 区域为单链状态，可与反向内引物 BIP 的 B2 序列结合引导 DNA 合成。并且哑铃状结构 3’端又可以自身序列为模板引导合成 DNA 链。由此便建立了循环过程，不断地延伸和发生链置换，茎环个数逐渐增加，最后的产物是由一系列交替反向重复靶序列构成的不同个数茎环结构、多环花椰菜样结构的 DNA 片段混合物。LAMP 反应的产物相当复杂，后续无法进行回收、鉴定、克隆等基因工程实验。在反应体系中添加 2 条环状引物 Loop F 和 Loop B，识别茎环结构并不断延伸，使双链过早打开，有利于复杂茎环结构的成环和外引物的链置换合成，在一定程度上加速了整个 LAMP 扩增循环阶段的反应。
LAMP的检测方式 LAMP 反应产物的检测方法包括：电泳法、浊度法和染料法，其中电泳法和浊度法是终点检测法，而染料法现在更为常用，可实现实时检测。 1. 电泳检测 与常规 PCR 一样，在 LAMP 反应结束后可以通过电泳检测的方式判断目的基因是否发生扩增。由于 LAMP 的最终产物会有多种结构，因此电泳的结果显示为弥散状，而不像常规 PCR 只有 1 条或几条条带。终点法的弊端是只能判断目的基因是否存在，而不能对初始样本中目的基因的含量进行界定。 2. 比浊检测 比浊检测的原理与 LAMP 反应中反应组分的消耗及相关化学反应有关，DNA 合成过程中会消耗 dNTP，并产生焦碳酸根离子，而焦磷酸根离子会和反应体系中的镁离子发生反应，生成焦碳酸镁白色沉淀。在 LAMP 反应结束后，可以通过肉眼观察或者浊度仪检测是否有白色沉淀生成，如果有白色沉淀，那就说明待测样本中含有目的基因。 3. 染料法 LAMP 反应的检测方法较常见的是染料法。在 LAMP 反应体系中加入染料，通过 LAMP 反应前后所观察到的颜色变化或者荧光信号来判断待测样本中是否包含目的基因。 LAMP 染料法中用的染料包括两种：
假阳性问题的原因和解决方法 LAMP 反应在操作过程中极易受到污染而产生假阳性结果，并且 LAMP 的反应结果只有两种，即扩增与不扩增，故在产生非特异性扩增时难以进行后续的鉴定。 LAMP 扩增过程中产生假阳性的原因有：
因此，LAMP 扩增实验过程中要特别注意严谨操作，解决方法：
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