qPCR技术介绍（四）——数据解析篇

我们将已知浓度的标准品进行梯度稀释，作为模板进行Real Time PCR，就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。根据Ct值与起始模板数的对数值之间的线性关系，就可以制作出【标准曲线】。

未知浓度的样品的Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量，这就是qPCR的定量原理。

标准品要满足以下条件：

1. 浓度或拷贝数是已知的。

2. 与实际检测样品间的扩增效率一致。

如果待检测的模板是基因组DNA，就要选择基因组DNA作为标准品。但很难获得目的基因浓度是已知的基因组DNA时，或者目的基因的丰度较低时，对于DNA起始的材料必须构建质粒。

所构建的质粒标准品，不仅要具有目的序列，还要在目的序列的两侧各多加一段序列，使其更加接近实际检测样品的结构，以保持与实际检测样品间的扩增效率的一致性。

进行mRNA表达解析时，最好选择表达目的基因的Total RNA或以Total RNA为模板合成的cDNA作为标准品。但很难获得目的基因浓度是已知的的Total RNA时，必须构建体外转录RNA。

准备5～6个梯度稀释的标准品

将这些标准品作为模板进行Real Time PCR反应

得到各浓度下的Ct值

通过Ct值与起始模板浓度的对数值之间存在的线性关系，制作出标准曲线

标准曲线的制作不需要人工操作，由仪器自动完成。

理想的标准曲线

评价标准曲线的优劣有两个指标，相关系数（r²）和斜率（slope）。

相关系数反映标准曲线的直线性，理想值应大于0.98，越接近于1说明直线性越好，定量越准确。

斜率反映PCR扩增效率（E），PCR理想的扩增效率应在0.9<E<1.1范围, 如果PCR扩增效率低时必须重新设计引物; 如果PCR扩增效率比理论值高时，说明反应体系中有可能存在对反转录反应或PCR反应的阻害物质，需要改进提取方法。

PCR反应结束后，将PCR反应液的温度渐渐升高，实时监测TB Green的荧光信号强度变化。

起初，PCR扩增产物呈双链，具有较高的荧光信号强度

随着温度的渐渐升高，DNA双链渐渐打开，嵌入DNA双链中的TB Green数量减少，荧光信号强度就渐渐降低

当双链DNA解链一半时，荧光信号强度急剧下降，此时的温度即融解温度（Tm值）