引物设计的优劣,是影响定量PCR实验结果的重要因素之一。有些引物反应性能差,可以通过反应条件优化得到改善,但大多数情况改善效果并不是很明显,所以,预先设计反应性能良好的引物尤为重要。
除此之外,引物的长度、扩增片段长度以及基因组结构等参数都要加以考虑,下表总结了引物设计原则,★号表示重要程度,★号越多,表示该参数越重要,设计时要优先考虑。
采用荧光探针检测法时,要同时考虑引物和探针的质量。通常首先要寻找合适的探针位置,再进行引物的设计,然后再将引物和探针之间进行比对分析,应该说设计上比采用荧光嵌合法更加困难和繁琐。下表总结了探针设计原则,★号表示重要程度,★号越多,表示该参数越重要,设计时要优先考虑。
通常可以使用引物设计专用软件进行引物、探针的设计,如Primer Premier、Oligo 7等,也可以利用NCBI网站功能,无需下载软件也可进行设计,并可以进行特异性的比对。
新设计合成的引物,首先必须进行预实验,对反应性进行确认。
模板使用梯度稀释的cDNA溶液即可,每个反应加入相当于Total RNA 1 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng的cDNA,对PCR扩增效率、检测灵敏度、无模板对照和gDNA来源的扩增4个方面进行确认。
如果预实验显示,PCR扩增效率低或有引物二聚体等非特异性扩增时,需要对PCR条件进行优化,优化可以按下图的顺序进行。
如果条件优化后结果仍无改善,必须重新设计引物。
qPCR常用于对样本中的DNA或RNA进行定量,在对RNA进行定量的时候,需要先进行反转录反应(RT反应),将RNA反转录为cDNA。
Two Step RT-PCR反应是将反转录反应和qPCR反应分两步进行;One Step RT-PCR的反转录反应和PCR反应在同一反应管内连续进行。
Two Step RT-PCR反应,可选择Random Primer、Oligo dT Primer或基因的特异性引物进行反转录反应,然后再将一部分反转录反应液(cDNA)作为模板添加到Real Time PCR反应液中。使用反转录引物时可以根据实验目的选择最合适的反转录引物,如果选择Random Primer或Oligo dT Primer,合成的cDNA可用于复数种类基因的检测,cDNA溶液可以稳定地长期保存,供以后解析使用。
One Step RT-PCR的反转录反应和PCR反应在同一反应管内连续进行,操作简单,污染几率低。反转录反应需要使用基因特异性引物 (GSP),即基因特异性PCR下游引物,因此,能够对特定基因进行高感度检出。
以前,Two Step RT-PCR的反应性能占有优势,但近些年来由于对试剂盒的不断改良,One Step RT-PCR也能够实现良好的反应性能。
究竟采用何种方法,可根据实验目的自由选择。例如,病毒、病原菌检测,适合使用操作简单的One-Step RT-PCR方法;基因表达解析等目的基因数多时,适合使用通用引物的Two Step RT-PCR方法;样品数多时,Two Step RT-PCR的操作显得过于繁杂,而One Step RT-PCR就很方便。
另外,One Step RT-PCR因使用基因特异性反转录引物,Total RNA的添加量即使很多,也能够高效率反应,所以,有利于低表达基因的检出。