|
qPCR技术介绍（二）——RNA提取&逆转录RNA操作的注意 RNA模板的质量 RNA的纯度会影响cDNA的合成量，所以在提取RNA后需要进行RNA纯度和质量检测。 吸光度测定方法 OD260/OD280（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.0之间。当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。 在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TE Buffer。 根据OD260，可以计算提取的RNA浓度： RNA浓度 (µg/µL） = (A260-A320）×稀释倍数×0.04 凝胶电泳方法 利用1%的琼脂糖凝胶（含溴乙锭）电泳结果，对提取的Total RNA进行RNA完整性以及是否有基因组DNA污染的评价。 如果可以清晰观察到两条rRNA条带（真核生物：28S和18S；原核生物：23S和16S），且其浓度比值大约为2:1，则RNA未降解。 若观察到smear现象，则RNA已发生降解。 如果观察到大于28S或23S的条带，则样品可能有基因组DNA污染，这时可以考虑使用DNase I处理。
逆转录引物的选择
Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer 利用Real Time RT-PCR进行基因表达解析时，将Random Primer和Oligo dT Primer混合使用效果更佳，不仅可以在mRNA全长范围内高效率逆转录，还可以将mRNA二级结构及mRNA分解的影响控制在最小限度。 RNA模板中混入基因组DNA的处理 首先确认目的基因的基因组结构，选择跨越较长的内含子。然后，在这个内含子两侧的外显子上分别设计上、下游引物。 Real Time PCR反应时通常扩增的目的DNA片段长度都比较短，设置的条件也是适合短片段DNA的扩增，超过500 bp就很难扩增了。所以，当内含子足够长时，基因组DNA来源的扩增就不能发生。
当内含子较短时，可将其中一条引物设计在exon junction上，这样，基因组DNA来源的扩增也不能发生。但是，此种方法不适合具有单个外显子的基因、或者不具有内含子的生物种以及基因组情报没被解析的生物种等。
使用常规方法提取Total RNA后，再使用DNase I 分解混入的基因组DNA，最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化Total RNA。或者使用能去除基因组DNA的逆转录试剂进行逆转录反应。亿目思明星产品All-in-one RT SuperMix( gDNA Removal) （Code No. 20123）是可以除去基因组DNA的定量PCR专用逆转录试剂，试剂盒中附带gDNA Removal，逆转录的同时去除基因组DNA。 |
