下一代分子诊断技术：CRISPR/Cas技术总结

      广泛应用于核酸检测的三种Cas12a蛋白包括LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a，其中LbCas12a的反式切割活性最强。2017年Jennifer Doudna团队开发了DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）检测技术，利用LbCas12a（Lachnospiraceae bacterium ND2006）与crRNA复合物，并在crRNA引导下利用RuvC结构域切割PAM（TTTN）序列下游18~25nt的靶DNA，在识别并切割靶标dsDNA的同时，激发Cas12a的反式切割活性，切割反应体系中的ssDNA报告分子。ssDNA报告分子标记有荧光基团和猝灭基团，一旦切割，荧光基团和猝灭基团被分离，就会产生稳定而强烈的荧光信号，荧光信号的强度可以指示检 测样本中靶标的量。此外，DETECTR还与重组酶聚合酶等温扩增技术结合（recombinase polymerase amplification，RPA），不仅提高了检测分析的灵敏度（amol/L水平），而且避免了对复杂、昂贵设备的需求。该技术现已成功应用于人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）和SARS-CoV-2的检测。

DETECTR检测方法原理图

     2018年王金、赵国屏团队建立了HOLMES（one-hour lowcost multipurpose highly efficient system）检测技术，联合LbCas12a与PCR扩增，可以在1 h内完成对伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）和日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的检测，灵敏度可以达到1～10 amol/L，此外还可以准确区分病毒基因型以及人类的单核苷酸多态性 。但是，该技术联合PCR扩增提高稳定性的同时也增加了检测时间和设备依赖性。

      来源于嗜热菌的Cas12b含有单个RuvC结构域，脱靶效应低且同样具有反式切割活性。CRISPRCas12b是双RNA引导的DNA核酸内切酶系统，可以识别和切割靶向dsDNA或ssDNA，也可以非特异性切割ssDNA。当靶向dsDNA时，Cas12b依靠PAM序列（TTC或TAC）完成顺式切割。当靶向ssDNA时，Cas12b可不依赖PAM序列实现切割，而且切割活性高于dsDNA。

      根据这些特性，王金、赵国屏团队建立了升级版的HOLMESv2，将AacCas12b（Alicyclobacillus acidoterrestris）蛋白与环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）结合，只有含有5ʹ-TTC-3ʹ的dsDNA或切割后具有的5ʹ-TAC-3ʹ的DNA序列才能激活AacCas12b反式切割活性，该技术实现了DNA、RNA特异性检测以及区分SNP和定量DNA甲基化。

     2019年，Dai等开发了基于CRISPR-Cas12a的E-CRISPR检测技术，通过CRISPR-Cas系统来影响电信号输出，利用Cas12a的反式切割活性获得高传导信号。该检测技术将修饰有3′-亚甲基蓝（3′-MB）标签的ssDNA报告分子固定于金电极上，在靶DNA存在的情况下，Cas12a-crRNA反式切割MB-ssDNA分子，亚甲基蓝标签的分离，会使电化学信号降低。在没有靶标DNA存在时，Cas12a的反式切割活性保持沉默，ssDNA分子保留在电极表面，从而导致亚甲基蓝的高电化学电流。

SHERLOCK检测方法原理

      2020年，Ding等开发了AIOD CRISPR（all-in-one dual CRISPR-Cas12a）检测技术，将RPA扩增和CRISPR检测的所有反应组分混合，在引入两个crRNA的同时，添加高浓度ssDNA报告分子，一步即可完成对SARS-CoV-2和HIV-1的检测。

      Cas13是RNA引导和RNA靶向的核酸酶，具有两个HEPN结构域，特异性作用于RNA靶标。2017年，张峰团队开发了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）核酸检测技术。该技术与DETECTR原理相同，但依赖于LwaCas13a（Leptotirichia wadei）核酸酶的活性，识别和切割靶标RNA的同时，反式切割ssDNA报告分子产生荧光信号。

SHERLOCK检测方法原理

   为了解决定量的问题，该团队开发了SHERLOCKv2，将4种类型的Cas蛋白（LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a）组合使用，切割用不同的荧光基团标记的报告分子，在FAM、Cy5、HEX和TEX通道中进行检测，实现了定量同时检测4种核酸序列。SHERLOCKv2也被应用于侧向流动分析，通过金纳米颗粒标记的抗FAM抗体，在试纸条上检测被切割的报告分子，产生视觉比色信号。

SHERLOCKv2 检测结果读取方式

      2020年，ACKERMAN等联合CRISPR诊断和微流控技术开发了CARMEN（combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids）检测平台，该技术可以同时检测8个样本，169种人类相关病毒。但由于芯片定制成本高和检验操作流程复制，很难应用于临床。该团队在CARMENv.1的基础上开发了mCARMEN（microfluidic combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids），将CRISPR诊断、微阵列技术与简化的临床工作流程相结合，开发的mCARMEN呼吸道病毒检测面板，可同时检测21种呼吸道病毒，包括SARS-CoV-2及其他冠状病毒、流感病毒等。

CARMEN-Cas13检测方法原理

      Arizti-Sanz团队将扩增与CRISPR-Cas13系统检测整合为一步诊断平台SHIN（streamlined highlight of infection to navigate pandemic），通过添加RNase H提高核酸检测灵敏度，并采用管内荧光和配套的智能手机应用程序，实现了SARS-CoV-2有效的核酸检测。SHINE诊断平台最大限度地减少了对设备的要求，也减少了结果读数偏差。

    除了Cas12和Cas13系统外，结构紧凑的Cas14蛋白也具有类似的反式切割活性。Cas14是一种靶向ssDNA的CRISPR内切酶，与CRISPRCas12相比，Cas14识别和切割目标核酸序列不受PAM序列的限制，而且对crRNA与靶标模板之间的核苷酸错配的容忍性更低，内部序列对核苷酸错配更敏感，这一特性使Cas14能够实现高保真的区分SNP。基于此特性建立的Cas14a-DETECTR检测平台，已应用于人类HERC2基因SNP分型。

CRISPR/Cas14a分子检测示意图

      发展至目前，基于CRISPR的核酸检测技术具有以下优点：

(1)高特异性，可实现单核苷酸点突变检测；

(2)高灵敏性，可实现单拷贝核酸检测；

(3)快速性，整个检测在0.5–1.0h内完成；

(4)简便性，不需专业设备及人员，可现场完成；

(5)试剂耐受冷冻干燥，便于储存和携带；

(6)易开发性，可快速开发出新核酸检测试剂盒等。

      随着进一步的改进和优化，其更具通用性，CRISPR核酸检测技术将成为POCT的最优选。

已报道的多种基于 CRISPR 的分子检测技术比较

      第一，是新的Cas蛋白的开发及突变体的筛选鉴定。例如后来发现的Cas14蛋白，不同于Cas12和Cas13，其擅长识别单链DNA，丰富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的筛选鉴定为提高检测通量及降低“脱靶效应”提供了方法。

      第二，是将CRISPR/Cas其和其他的技术平台结合起来，开发新颖实用的生物传感策略。比如将Cas9蛋白固定于石墨烯场效应晶体管，以及将Cas系统的报告探针固定于电极上，从而实现不需要使用信号扩增的电化学生物传感器的构建。使用水凝胶作为其响应原件实现多样化的信号输出。与微流体技术结合开发出的CARMAN技术，可以对数十个样本，上百种病毒进行快速检测，为解决通量低的问题提供了方法等。