无缝克隆实验常见问题与解决办法

(一) 线性化载体的制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量在40% - 60%之间的位点进行克隆。线性化的方法有酶切制备和反向PCR扩增制备。

1. 酶切制备酶切制备线性化载体时，推荐使用双酶切方法使载体线性化完全，降低转化背景（假阳性克隆）；若使用单酶切线性化，请适当延长酶切时间以减少环状质粒残留，降低转化背景。

注：a. 经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化。反应体系内无DNA连接酶，不会引发载体自连。因此，即使是单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理；

b. 酶切完成后，应快速将内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应；

c. 酶切后进行胶回收纯化，纯化后通过琼脂糖凝胶电泳检测产物。

d. 重组产物转化后出现的假阳性克隆（无插入片段），是由未线性化环状载体转化而形成。

2. 反向PCR扩增制备推荐使用高保真聚合酶扩增减少碱基突变的概率。50μl的PCR体系中，推荐使用0.1 - 1ng环状质粒模板，或使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

注：通过胶回收纯化PCR产物，推荐纯化后通过琼脂糖凝胶电泳检测其质量和浓度。

(二) 插入片段的制备

引物设计总原则插入片段扩增引物由两部分构成：重叠区域 + 特异性引物。在插入片段正反向扩增引物的5’端引入线性化载体两末端同源序列，使扩增后的插入片段5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列（15 - 20 bp，不包括酶切位点）。

插入片段正向扩增引物设计方式为：

5’-上游载体末端同源序列 + 酶切位点（可保留或删除）+ 基因特异性正向扩增引物序列-3’

插入片段反向扩增引物设计方式为：

5’-下游载体末端同源序列 + 酶切位点（可保留或删除）+ 基因特异性反向扩增引物序列-3’

▲基因特异性正/反向扩增引物序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列，Tm值60 - 65℃为佳；

▲上/下游载体末端同源序列即线性化载体最末端序列(用于同源重组)，GC含量40% - 60%为佳；

▲计算扩增引物Tm值时，只需计算特异性引物的Tm值，引入的额外序列无需计算。

(三) 线性化载体与插入片段的使用量

最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng (0.03 pmol)最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng (0.06 pmol)

注：

a. 插入片段长度大于克隆载体时，最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即将插入片段当做克隆载体，克隆载体当做插入片段进行计算。

b. 线性化克隆载体的使用量应在50 - 200ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在10 - 200ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。

c. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物未进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4μl。

(四) 常见问题

1. 不长菌或菌落数很少：

目的片段大，不好克隆或克隆容易有突变怎么办？PCR进行目的片段扩增时一定要采用高保真酶，对于大片段的扩增要采用兼容大片段的高保真酶，推荐亿目思的高保真酶Pfu或KOD，可适用于15K以内的片段扩增。

2. 目的片段扩增时出现非特异性条带

a) 胶回收目的片段，并电泳鉴定回收纯度和浓度。

b) PCR引物设计的问题，可设计多对引物，选择出特异性最好的一对。引物设计原则：

i. 引物长度常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度太高，不适合 DNA 聚合酶进行反应；

ii. 3’端最好不要有A，5’端可以容忍二聚体，但3’端一定不要有二聚体；

iii. 不要有连续的GGG 或CCC、GCGC、CGCG之类，不要有错配，前后引物的退火温度要差不多，差异在2度以内；

iv. 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；

v. Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；

vi. 引物之间的Tm值相差避免超过2℃；

vii. 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基，引物3'端要避开密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率；

viii. 引物的设计好后使用Blast 验证。

c) 优化PCR反应体系，可考虑优化退火温度等PCR参数。

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