1、目的及适用范围
通过木瓜蛋白酶酶切从IgG中得到Fab片断。
2、主要仪器
AKTA FPLC、HiTrap Protein G、Hitrap Protein A、冷冻离心机
3、试剂及配置方法
3.1抗体结合Buffer：20 mM sodium phosphate, pH 7.0
3.2抗体洗脱Buffer：0.1 M glycine-HCl, pH 2.7
3.3 Papain Agrose（Sigma）：40U/mL
3.4 papain酶切Buffer：50mM Tris 150mM NaCl 1mM EDTA 1mM DTT，pH 7.0
4、相关的预处理
在酶切前将Papain Agrose换液至Papain酶切Buffer，加入10mM Cysteine，37℃激活30min。
5、操作步骤
5.1 Protein G从腹水或血清中纯化IgG。
5.1.1样品处理：将腹水或血清4℃，12000rpm离心10min，取上清 ，稀释于4-5倍体积的Binding Buffer中，并用0.45μm的滤膜过率滤。
5.1.2 安装Protein G柱，设置压限0.3MPa。
5.1.3 用水冲洗整个系统。
5.1.4 用Binding Buffer洗泵，并用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子
5.1.5 上样，流速0.5-1mL/min
5.1.6 用Binding Buffer冲洗柱子直到紫外吸收线走平为止
5.1.7 用2-5柱体积的Elution Buffer洗脱抗体。
5.1.8 1mL/管收集蛋白，每个收集管加入pH9.0的1 M Tris-HCl 60–200 μL（预实验算好加的体积）。
5.1.9 SDS-PAGE检测纯化结果。
5.2 将纯化的IgG换液至Papain酶切Buffer。
5.3 加入预处理好的Papain Agrose，37℃酶切4h。
5.4 将酶切后样品与Protein A结合，收集穿透，为切出来的Fab。
6、注意事项
6.1 所用缓冲液在使用前需用0.45μm的滤膜过率滤。
6.2 注意木瓜蛋白酶的有效时间。
6.3 注意监测酶切时间
7、问题向导
酶切后SDS-PAGE检测仍有完整的重链条带？
酶切时间不够，延长酶切时间或者增大酶的用量。
