1、目的及适用范围
利用GST亲和层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。
2、主要仪器
GST柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机
3、主要试剂
3.1 Binding Buffer：1×PBS
3.2 Elution Buffer：20-50mM还原型谷胱甘肽
3.3 高pH值缓冲溶液：0.1M Tris，0.5M NaCl，pH 8.5
3.4 低pH值缓冲溶液：0.1M 醋酸钠，0.5M NaCl，pH 4.5
4、GST柱的预处理
用5个柱体积的1×PBS缓冲溶液平衡柱子
5、操作步骤
5.1蛋白的纯化
5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；
5.1.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；
5.1.3 将收集的菌体用1×PBS重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；
5.1.4 将菌体用1×PBS重悬，超声破碎菌体；
5.1.5 4℃，12000rpm，离心15min，收集超声后上清；
6.1.6 将收集的上清加入GST柱子中，4℃结合2h；
5.1.7 流出穿透液；
5.1.8 用20-30个柱体积的1×PBS冲洗柱子，除去非特异性结合的杂蛋白；
5.1.9 用1-3个柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白；
5.1.10将诱导前全菌，诱导后全菌，穿透，洗脱样品进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。
5.2 柱子的再生
5.2.1 用3个柱体积的高pH缓冲溶液冲洗柱子；
5.2.2 用3个柱体积的低pH缓冲溶液冲洗柱子；
5.2.3 重复1、2两步2次；
5.2.4 用5个柱体积的1×PBS冲洗柱子；
5.2.5 用2个柱体积的6M盐酸胍冲洗柱子；
5.2.6 用4个柱体积的70%乙醇冲洗柱子；
5.2.7 用5个柱体积的1×PBS冲洗柱子；
5.2.8 若要长期保存（大于1个月），用10个柱体积的1×PBS冲洗柱子2次；
5.2.9 用3个柱体积的20%乙醇冲洗柱子，并保存于4℃。
