1、目的及适用范围
该SOP用来规范细胞培养的标准操作规程。
2、主要仪器
CO2恒温水浴细胞培养箱、超净工作台（生物安全级）、生物安全柜、自动吸引器、电动移液器、微量移液器、酒精灯、显微镜、普通台式离心机、冰箱、超低温冰箱、液氮罐、烘箱、灭菌锅、水浴锅、培养皿（直径10cm、6cm、3.5cm）、细胞培养板（6孔、12孔、24孔，96孔）、冻存管、10mL移液管、吸管、离心管
3、试剂及配制方法
3.1 DMEM：每包DMEM配置1升培养基，加入NaHCO3 3.7g/L，HEPES10mM，pH7.2。4度保存。
3.2 胰酶：胰酶粉2.5g/L EDTA-2Na 0.34g/L 使用PBS配置。pH7.2。4度保存。
3.3 EDTA：5mMEDTA-2Na。 PBS配置，pH7.2。
3.4 PBS：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 3.58g，KH2PO4 0.24g，pH7.2~7.4
3.5 青霉素、链霉素：使用PBS配置，浓度为1000万U，用0.22μm小滤器，过滤灭菌。-20度保存。使用时按1：1000稀释。
4、相关器皿的预处理
培养细胞所需的EP管，玻璃器皿等，需要在灭菌锅中高压灭菌。细胞培养所需的培养皿等，均为一次性无菌包装。
5、操作步骤
5.1 配置细胞培养液，90%DMEM，10S。如需要加入双抗终浓度为10000U/mL。
5.2细胞复苏
5.2.1将细胞冻存管从液氮中取出，迅速在37℃水浴锅中加温，使细胞液融化。
5.2.2将冻存管在台式离心机中800rpm5min离心。弃上清。
5.2.3将细胞沉淀吹打均匀在3mL培养基中，至于6cm皿中，将培养皿放入CO2恒温培养箱中静置培养。
5.3细胞传代
5.3.1使用电动吸引器，沿培养皿壁吸去废液。
5.3.2加入PBS，清洗1~2次。吸去废液。
5.3.3沿培养皿壁加入胰酶，以没过培养皿底层为限。37℃或室温消化。
5.3.4待到细胞形态变圆，吸去胰酶，用适量的培养基吹打细胞，使其均匀悬浮于细胞液中。
5.3.5取新的细胞培养皿，将上一步得到的细胞悬液均匀分为几份，加入到培养皿中，加入新的DMEM，每皿共8~10mL。
5.3.6置于37℃培养。
5.4细胞冻存
5.4.1细胞冻存液的配制：60%DMEM，30%血清，10%DMSO。
5.4.2细胞冻存的密度最好在3×106～1×107/mL。
5.4.3将细胞悬液置于离心管中，800rpm，5min离心。
5.4.4小心弃上清，用细胞冻存液重悬细胞。
5.4.5将重悬好的细胞分装，每只冻存管不要超过1.5mL。
5.4.6将冻存管先置于4度30min，-20度2h，-80℃过夜，然后放入液氮罐中保存。
五、注意事项
1、HepG2细胞在处理的过程中，在加入胰酶消化细胞后。不吸出胰酶，直接加入培养基重悬细胞，入15mL离心管。800rpm 5min，弃上清，重新用培养基重悬，分置于培养皿中培养。
2、MDCK细胞在加入胰酶消化细胞之前，应加入EDTA溶液37℃处理5~10min，然后按照步骤进行操作。
