1、目的及适用范围
该SOP用于规范用抗体检测蛋白的表达的操作。
2、主要仪器及试剂
SDS-PAGE电泳槽、转膜仪、压片暗盒、洗片机、SDS-PAGE电泳缓冲液、转膜Buffer、TBST、封闭液、一抗、二抗、底物显色液、显影液、定影液
3、操作步骤
3.1 收集蛋白样品：可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
3.2 电泳
3.3 SDS-PAGE凝胶配制：SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制；
3.4样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。100℃或沸水浴加热3-5 min，以充分变性蛋白。
3.5上样与电泳： 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80～100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90～120 min。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3.6转膜：推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜（NC膜）也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60 min。也可以在15-20mA转膜过夜。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液（P0022）对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液（P0017）对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
3.7封闭： 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，漂洗1～2min，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。加入用TBST配置的4％脱脂奶封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭1～2h。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。
3.8一抗孵育： 参考一抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释一抗。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1h。如果一抗孵育1h效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或根据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。回收一抗。加入TBST，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10min。3×10min。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体或Actin抗体，进行内参检测。
3.9二抗孵育： 参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗。洗脱好的膜立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入TBST，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10min。3×10min。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
3.10蛋白检测：参考相关说明书，使用显色液来检测蛋白。压片可以采用专用的压片暗盒进行。 洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片。
3.11膜的重复利用：如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Stripping buffer处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
4、注意事项
4.1注意根据蛋白的大小，调整胶的浓度和电泳的时间长短。
4.2注意根据蛋白的大小，调整转膜的电流大小和转膜时间。
4.3选择合适的一抗和二抗的抗体浓度及结合时间，压片时间长短的摸索。
