1、目的及适用范围
该SOP用于规范细胞内水平检测蛋白-蛋白的相互作用的操作。
2、主要仪器
微量高速冷冻离心机、移液枪、垂直混匀仪、电泳设备、vortex震荡器、液氮及组织粉碎器、离心管
3、试剂及配制方法
细胞或组织、蛋白定量kit、SDS电泳试剂、抗体、PBS、细胞裂解液（加蛋白酶抑制剂cocktail）、洗脱液（根据蛋白的结合力调整洗脱液中NaCl的浓度）
4、操作步骤
4.1 将质粒转染293T细胞系，转染试剂用PEI，具体方法参照转染方法。转染36～48 h，用细胞裂解液裂解细胞，12000 rpm 离心10 min。将上清用于实验或者保存于-80℃待用。
质粒12
pCMV-Myc- CypA
pCDNA3-Flag-M1 -
4.2 Flag beads的处理：根据实验样品的多少，吸取Flag beads（5μL/样品），用PBS洗脱3遍。每次4500 rpm离心3～5 min。
4.3 蛋白与Beads的结合以及抗原的检测（在4℃进行）：将收集样品与Flag beads结合。根据两种蛋白的结合力调整结合时间及温度，本实验为4℃ 结合2 h。4500 rpm离心5 min去除细胞培养液，细胞洗脱液洗涤Flag beads，垂直混匀仪上处理10 min，4500 rpm离心5 min，弃掉上清，反复洗涤5-6次。最后将结合有蛋白的Flag beads，加2×SDS-PAGE 上样 buffer 10μL，煮样 10 min。跑SDS-PAGE 胶，做Western blot检测。样品顺序如下：
pCMV-Myc-CypA
细胞裂解液pCMV-Myc- CypA
pCDNA3-Flag-M1
细胞裂解液pCMV-Myc-CypA
Flag beadspCMV-Myc- CypA
pCDNA3-Flag-M1
Flag beads
5、问题向导
5.1 不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
5.2 对电泳的非特异条带，可提高洗脱液中NaCl的浓度来去掉。
