1、目的及适用范围
本SOP适用于快速提取哺乳动物细胞染色体外DNA的操作。
2、主要仪器
CO2细胞培养箱、台式高速离心机、吸附柱：QIAprepTM Spin Column
3、试剂及配制方法
3.1 Buffer 1： 50mM Tris-HCl（pH7.5）
10mM EDTA
100μg/mL RNaseA
3.2 1.2% SDS
3.3 Buffer 2： 3M CsCl
1M 醋酸钾
0.67M 醋酸
3.4 Buffer 3： 80mM 醋酸钾
10mM Tris-HCl（pH7.5）
40μM EDTA
60% 乙醇
3.5 PBS
4、相关器皿的预处理
操作中涉及细胞的全部器皿均为无菌，全部基本溶剂为去离子水。
5、操作步骤
5.1 106-107个细胞经胰酶消化后，重悬，用Ca2 /Mg2 free的PBS洗三次。
5.2 将细胞团重悬于250μL Buffer 1中，再用250μL 1.2% SDS裂解。
5.3 将悬液上下颠倒，轻柔混合，室温放置5min。
5.4 将3中悬液转移至1.5mL 离心管中，加入350μL Buffer 2后立即将小管轻柔颠倒混匀，冰上放置15min。
5.5 12000rpm，15min，离心。
5.6 将上清转移至QIApre Spin Column中，14000g离心，1min。
5.7 取Buffer 3 750μL洗column，2次。
5.8 用50μL无菌水洗脱吸附柱即得到染色体外DNA。
6、注意事项
6.1 根据实际情况调整各溶液量。
6.2 过柱时注意延长结合时间，充分结合。
6.3 可参考改良的Hirt分离法(BioTechniques: 24:760-762 May 1998)。
