1、目的及适用范围
该SOP规范实现目的基因在酵母中的表达的操作。
2、主要仪器
250mL摇瓶、30℃恒温培养箱、离心机、50mL离心管、纱布、移液器、离心管
3、主要试剂及配制方法
BMGY培养基、BMMY培养基、100%甲醇
酵母表达常用溶液及缓冲液的配制：
3.1 10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵） 100g硫酸铵，溶于1000mL水中，过滤除菌。
3.2 500*B（0.02%生物素 Biotin）4℃保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100mL水中，过滤除菌。
3.3 10*D（20xtrose 葡萄糖）保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000mL水中，灭菌15min或过滤除菌。
3.4 10*M（5%Methanol 甲醇）保存期为2个月。将5mL的甲醇与95mL水混匀，过滤除菌。
3.5 10*GY（10%Glycerol 甘油）保存期为1年以上。将100mL甘油和900mL水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
3.6 1M 磷酸钾溶液（pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132mL与1mol/L的KH2PO4溶液868mL混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。
3.7 BMGY Buffered Glycerol-complex Medium、BMMY Buffered Methanol-complex Medium 1L
1% 酵母浸出物、2% 蛋白胨、100mM 磷酸钾（PH6.0）、1.34% YNB、4×10-5%生物素、1% 甘油或0.5% 甲醇
溶解10g酵母浸出物，20g蛋白胨于700mL水中，灭菌20min，冷至室温，加入下列混合液：
100mL1M 磷酸钾缓冲液 PH6.0
100mL 10×YNB
2mL 500×B
100mL 10×GY
制BMMY 时，加入100mL 10×M取代10×GY，存于4℃，可放2个月。
4、操作步骤
4.1 挑选一单菌落，置于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，于28～30°C/250-300 rpm培养至OD600 = 2-6 (16-18 h)；
4.2 室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右（约100~200mL）；
4.3 将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃/250-300 rpm的摇床上继续生长；
4.4 每24h向培养基中添加100％ 甲醇至终浓度为0.5～1.0%；
4.5 按时间点分别取菌液样品，取样量为1mL，置于1.5mL 离心管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；
4.6 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，待检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；
4.7 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
5、注意事项
5.1 防止污染，每个样品从平板上挑10个左右单克隆于2mL BMGY摇菌（30mL玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1mL，余1mL换2mL BMMY诱导表达，3、4层纱布足够了。污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100mL三角瓶，装量10mL培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。
5.2 换液，通常用BMGY和BMMY是要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGY里加甲醇诱导就行了。GS115在第4天达到了最高表达量。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高，
5.3 菌种保存，15%甘油做保护剂，-70℃长期保存，-20℃短期保存使用。不过要注意冻存前一定充分混匀，酵母菌体很容易沉降到离心管底部，保存效果降低。一般OD2-6的YPD过夜菌吸取300μL菌液到灭菌的离心管然后加等体积的甘油，混匀，放于-20℃．保存长的话最好放-80℃冰箱。
6、问题向导
6.1 菌株：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。
6.2 温度：在28℃和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。
6.3 pH：手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。
6.4 偏爱密码子：codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。
6.5 表达时间与空质粒转化对照：诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。
6.6 不表达：蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。
6.7 表达量：30KD，10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。
6.8 糖基化：酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1－3KD左右的糖基。另外可能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题 。
6.9 表型与表达：重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut 和Muts表型的菌株；前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut 表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。
