1、目的及适用范围
该SOP用于规范利用ELISA方法检测制备抗体的标价的操作。
2、主要仪器及试剂
离心机、冰箱、37℃恒温箱、酶标仪、洗板机、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、A、B底物反应液、终止液、HRP标记二抗（ELISA效价1:10000-100000）
3、操作步骤
3.1 目的蛋白的纯化；
3.2 免疫兔子或小鼠；
3.3 采集免疫动物的血清；
3.4 抗原包被，每孔包被抗原50-200ng，4℃包被过夜或37℃包被5h；
3.5 用封闭液37℃封闭3h或4℃封闭过夜，然后用PBST洗涤3次，每次2min；
3.6 将抗体（免疫血清）和阴性血清分别按1:1000，1:2000，1:5000，1:10000和1:50000稀释后，每孔加入50?L，37℃温育45min，用PBST洗涤5次；
3.7 加入相应的HRP标记二抗，37℃温育30min，用PBST洗涤5次；
3.8 每孔分别加入50?L A液和B液，然后每孔加入50μL终止液；
3.9 测定其A450nm，如果样品孔与阴性对照孔A450nm比值大于2.1最高稀释倍数为抗体效价。
3.10 抗体效价评定：一般来说，用重组蛋白作为抗原免疫动物所得到的免疫血清，其ELISA效价应不低于1:5,000。为了能更充分验证制备抗体的效价及特异性，最好是联合Western-blot及IFA等方法一起来检测制备抗体的效价及特异性。
4、注意事项
4.1免疫抗原选择要点
4.1.1尽量选择标签比较小的载体来纯化目的蛋白，而且在克隆目的基因时尽量去除载体序列。如可以选择PET-30a载体(His标签)作为表达载体时，尽量选择Nde I/Xho I这两个酶切位点来克隆目的基因。
4.1.2重组蛋白纯度应不低于90％。一般来说，纯度在90％以上的蛋白，取10μg电泳，在SDS-PAGE胶上应基本看不到杂带。
4.1.3选择制备抗体的重组蛋白要有良好的抗原性，也可选择目的蛋白上抗原性较好的部分用来作为免疫抗原。
4.2 包被抗原选择要点
选择与免疫用抗原不同标签的重组蛋白，如免疫抗原选择His标签，那么用来包被的抗原可以选择与GST标签融合的重组蛋白。
附：主要试剂的配制方法
1、包被缓冲液（pH 9.6 0.05 M碳酸盐缓冲液）
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸馏水至 1000mL
2、洗涤缓冲液（pH 7.4 0.15 M PBST）
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
加蒸馏水至 1000mL
加Tween-20至终浓度为0.05％
注：中性及微碱环境（pH7～8）有利于抗原抗体复合物的形成，而酸性条件有利于复合物的分解。
3、封闭液
BSA 3g
加PBST至100mL，溶解后-20℃保存备用
4、0.2M Na2HPO4
Na2HPO4·12H2O 7.16g
加蒸馏水至 100mL
5、0.1 M 柠檬酸
柠檬酸·H2O 2.10g
加蒸馏水至 100mL
6、0.1 M EDTA
EDTA 3.72g
加蒸馏水至100 mL，用NaOH 调pH值8.0
7、A、B底物反应液
A液： 0.2M Na2HPO4 51.4 mL
0.1M柠檬酸 48.6 mL
用HCl调pH值 5.0～5.4
30 % H2O2 67 ?L
加蒸馏水至 100 mL
B液： TMB 2HCl 50 mg
0.1M柠檬酸 5 mL
0.1M EDTA 0.5 mL
加蒸馏水至 100 mL
注：A、B底物反应液均用棕色瓶避光保存，使用时A、B液等体积加入。
8、终止液（2 M H2SO4）：蒸馏水178.3 mL，逐滴加入98％的浓硫酸21.7 mL
