1、目的及适用范围
该SOP用来规范慢病毒表达系统的操作。
2、主要仪器
CO2细胞培养箱、超低温冰箱、超净工作台（生物安全级别）、普通台式离心机
3、试剂及配制方法
puromycin 储存浓度100mg/mL，无菌过滤，保存于-20℃。
Lipofectamine TM 2000(Invitrogen)
4、相关器皿的预处理
操作中涉及细胞的全部器皿均为无菌，全部基本溶剂为去离子水。
5、操作步骤
5.1 确定puromycin对靶细胞的致死浓度：确定puromycin的浓度梯度，作用于靶细胞，一周后选择细胞全部死亡的最低浓度为致死浓度。
5.2 构建目的基因克隆：参照质粒图谱，将目的基因克隆至慢病毒体系的载体质粒中。
5.3包装慢病毒
5.3.1提前24h准备细胞6-8×106 293T / 10cm皿。使转染时细胞汇度达到80%以上。
5.3.2四质粒系统转染细胞，转染试剂为Lipofectamine TM 2000
pLL3.7-gene(vector) 15μg
VSVG 5μg
10cm皿 RSV/REV 5μg
pMDLG 5μg
5.3.3 4-6h后换液。
5.4收获慢病毒：48h后收获病毒。吸出细胞培养上清，2000rpm，10min离心。收取上清。可于-80℃保存。
5.5感染靶细胞
感染比例为：5mL病毒液/10cm 皿细胞，在感染时细胞汇度约为80%，12h后换液。
5.6 puromycin筛选阳性细胞
细胞培养2-3d后，确定的致死量，筛选阳性细胞，每隔2-3d更换培养基。待细胞停止死亡后，鉴定阳性细胞的蛋白表达量。可以使用获得的多克隆细胞或者进行单克隆化。
6、问题向导
6.1目的蛋白表达量低
可能原因：
*慢病毒包装效率低
解决方法：重新提纯质粒，保证转染质粒的质量；更换转染试剂，提高四质粒系统的转染效率。
6.2靶细胞在感染慢病毒后大量死亡或者状态变得不好
可能原因：
*慢病毒感染的MOI值过大
解决方法：降低慢病毒感染量
7、注意事项
7.1包装慢病毒对293T细胞的要求比较高，尽量选择状态好的细胞进行实验。
7.2包装好的慢病毒在-80度最多保存半年。
附：载体图例
