1、目的及适用范围
该SOP用来规范稳定表达细胞系的建立和鉴定的操作。
2、主要仪器及试剂
生物安全柜、CO2细胞培养箱、puromycin（100mg/mL，无菌过滤，保存于-20℃）、DMEM培养基、胎牛血清、PBS（pH7.4）
3、相关器皿的预处理
操作中涉及细胞的全部器皿均为无菌，全部基本溶剂为去离子水。
4、操作步骤
4.1使用慢病毒表达系统将目的基因导入靶细胞中，此部分内容请参见慢病毒表达系统标准操作规程。
4.2待靶细胞长满后传代，在细胞长至50%满时加入高浓度puromycin (一般为2倍致死量)筛选，每隔2d更换培养基。
4.3在细胞大量死亡直至出现可选取范围内剩下单个细胞时，降低培养基中puromycin浓度至普通致死量。在培养皿底将单个细胞的区域用记号笔圈起。
4.4此时细胞基本不再死亡，约3-4d后，单个细胞可以长成细胞团。此时将培养皿中培养基吸去，PBS冲洗细胞表面2遍，用200μL微量移液器吸取胰酶至细胞团区域，停留片刻后利用移液器的吸引力将这一区域的细胞吸起，转移至预先加入新鲜培养基的24孔板中，继续培养，此细胞克隆为单克隆。使用同样方法获得多株单克隆细胞。
4.5约10d左右，单克隆细胞可以扩大培养至10cm培养皿培养，冻存各株细胞后用Western Blot检测各株细胞的目的蛋白表达量，选择表达量高的克隆或适合试验要求的克隆株继续传代培养。
4.6各单克隆细胞培养至10代以上，可认为是稳定表达细胞株，可以进行鉴定。
4.7从核酸水平(RT-PCR)、蛋白水平(Western Blot、IF、FCM)、细胞水平等鉴定稳定表达细胞系。
5、注意事项
细胞消化传代时用不含有puromycin的培养基培养，待细胞贴壁后再加入puromycin，防止在抗生素压力下细胞无法贴壁。
6、问题向导
6.1 在高浓度puromycin中细胞死亡很快
可能原因：
此种细胞本身对puromycin非常敏感，在高于致死量的抗生素浓度中容易死亡，此时应该密切观察细胞状态，适时更换培养基，降低抗生素浓度。
6.2在puromycin压力下能够生存的细胞未表达目的蛋白
可能原因：
目前本室只有MDCK细胞出现过这种情况，MDCK细胞本身对puromycin有很高的抗性。可能需要提高抗生素浓度筛选，或者换用其他方法。
