1. 目的
该SOP是利用具有血凝性的病毒凝集动物红细胞的能力可以被相对应的抗体抑制使其不能再凝集红细胞的现象来测定与该病毒相对应的抗体的效价。
2. 适用范围
该SOP适用于具有血凝性的病毒类疫苗免疫动物后血清抗体的检测并依此进行疫苗的效力检验，可用于猪流感疫苗、禽流感疫苗、猪细小病毒疫苗、鸡减蛋综合症灭活疫苗等的效力检验；免疫后及时监测，辅助诊断病毒性疾病。
3. 主要仪器
1000～5000rpm台式离心机、冰箱、微量振荡器、96孔V型血凝板、八道加样器、200μL单通道加样器、积液槽
4. 试剂
4.1 生理盐水、柠檬酸三钠、重铬酸钾、硫酸、蒸馏水
4.2抗凝剂的制备
用天平称量3.8g柠檬酸三钠，溶入100mL生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
4.3 红细胞悬液的制备
4.3.1 红细胞的采集：选1～2只健康鸡，将血液采集到等量抗凝液中混匀，置4℃冰箱保存。
4.3.2红细胞悬液的制备：以800～1000rpm离心5min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中800rpm离心5min，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液。放入4℃冰箱中可保存2～3d。使用时用1mL吸管吸取0.1mL红细胞，然后加入9.9mL的生理盐水，此即1%红细胞悬液。
4.4 清洁液的制备
4.4.1 1%的稀硫酸溶液：水10kg，硫酸100mL，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌。
4.4.2 96孔V型板和微量滴头清洁液的配制：重铬酸钾79g，水1000mL，硫酸100mL，将重铬酸钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100mL，不断搅拌。
5. 操作步骤
5.1血凝试验（HA）步骤
5.1.1用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25μL。
5.1.2用微量移液器吸取待测抗原25μL于第1孔中并挤压6次混合，后吸出25μL至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25μL。
5.1.3微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μL。
5.1.4 置于微量振荡器上振荡1min，室温静置30min后观察结果。
5.1.5 结果判定：将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。
5.2 抗原校正
5.2.1 根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。
5.2.2首先用微量移液器向反应板的第2孔至第6孔加生理盐水25μL，第1孔不加。
5.2.3用微量移液器吸取4单位抗原25μL分别加入第1孔、第2孔中，从第2孔开始挤压6次混合，后吸出25μL至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25μL。
5.2.4 用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1～6孔，每孔25μL。
5.2.5置微量振荡器上振荡1min，室温静置30min后观察结果。
5.2.6 结果观察：第1、2、3孔为完全凝集，第4孔红细胞为50%沉淀，第5孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。
5.3 血凝抑制（HI）试验步骤
5.3.1 用微量移液器先加25μL生理盐水于各孔中。
5.3.2 用微量移液器吸取待检血清25μL置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25μL。最后1孔不稀释，为红细胞对照。
5.3.3 用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25μL。
5.3.4 置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置20min。
5.3.5 用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25μL。
5.3.6 置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀，室温静置40min后观察结果。
5.3.7 结果观察：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制试验滴度，以2的指数表示。
5.4 结果判定
“－”表示不凝集，红细胞沉积于管底，呈边缘整齐的圆盘状。
“ ”表示微量凝集。红细胞沉积于管底，呈边缘不清晰的圆盘状。
“ ”表示凝集，红细胞沉积于管底呈环状，四周有凝集的小块。
“ ”大部凝集，红细胞呈颗粒状凝集，边缘不整齐，有下垂趋势。
“ ”完全凝集，红细胞均匀铺于管底。
以能完全阻止血球凝集（“－”）的血清最高稀释度为血凝抑制效价。
5.5 试验用具处理
5.5.1 96孔V型反应板的清洗：新反应板可直接放入清洁液中浸泡24h，用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物，然后泡在清洁液中，24h后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤干备用。
5.5.2 微量滴头的清洗：新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中，最少浸泡24h，捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烤干，备用。
5.5.3 吸管及积液槽的清洗：将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24h后捞出，用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干，吸管放入高温干燥箱中160℃干燥1～2h后备用，玻璃制品可高温烤干。积液槽放入恒温箱中烘干。
6. 注意事项
6.1正确选用96孔微量板，根据所用红血球不同来决定，鸡血球选用V型板，豚鼠、人血球用U型板。
6.2红血球的浓度和4个血凝单位的正确调制。
6.3标准参比血清应包括疫苗株和代表株的。
6.4孵育时间不宜过长，有些病毒的血凝现象因病毒游离而很快消失。
7. 问题向导
7.1 由于流感病毒不同亚型间有交叉反应，判定结果时应注意。如试验用4种标准血清，待检病毒只能被甲3抗血清抑制，抗体效价为80，其他血清皆不抑制，那么，该鉴定病毒为甲3型流感病毒，HI效价为80。如果7待检病毒被甲3抗血清抑制，效价40，甲1抗血清抑制，效价320，其高出甲3抗血清效价4倍以上，故该待检病毒判定为甲1型流感病毒。标准参照血清对分离物的抑制效价≥20才可判断为阳性。若标准参照血清对分离物的抑制效价均<20，速将分离物送国家流感中心进一步鉴定。
7.2 鉴定未知病毒时对照应有红细胞、阴性血清对照、标准血清对照，HI试验不适用于流感的早期诊断，但在不能分离病毒或病毒分离阴性时，检测病人的急性期和恢复期双份血清有助于近期感染的诊断，即如恢复期血清抗体效价（滴度）高于急性期血清抗体效价≥4倍确诊可成立。
