核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法

20×SSC

■ 组份浓度    3.0 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠

■ 配制量      1 L 

■ 配制方法    

1. 称量下列试剂，置于 1 L 烧杯中。 

 NaCl                175.3 g  

柠檬酸钠·2H₂O  88.2 g   

2. 向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 

3. 滴加 14 N HCl，调节 pH 值至 7.0 后，加去离子水将溶液定容至 1 L。 

4. 高温高压灭菌后，室温保存。 

20×SSPE Buffer

■ 组份浓度    3.0 M NaCl，0.2 M NaH2PO4，0.02 M EDTA

■ 配制量      1 L 

■ 配制方法    

1. 称量下列试剂，置于 1 L 烧杯中。 

 NaCl                    175.3 g 

NaH2PO4·H₂O    27.6 g

 Na2EDTA·2H₂O      7.4 g

2. 向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 

3. 加 NaOH 调节 pH 值至 7.4（约 6.5 ml 的 10 N NaOH）。 

4. 加去离子水将溶液定容至 1 L。 

5. 高温高压灭菌后，室温保存。 

50×Denhardt’s 溶液

■ 组份浓度

1%（W/V）          Ficoll 400

1%（W/V）          Polyvinylpyrrolidone 

1%（W/V）          BSA 

■ 配制量      500 ml 

■ 配制方法    

1. 称量下列试剂，置于 500 ml 烧杯中。 

 Ficoll 400                     5 g 

 Polyvinylpyrrolidone       5 g 

 BSA                         5 g

2. 加去离子水约 400 ml，充分搅拌溶解。 

3. 加去离子水将溶液定容至 500 ml。 

4. 用 0.45 μm 滤器过滤后，分装成每份 25 ml。 

5. -20℃保存。 

0.5 M 磷酸盐缓冲液 

■ 组份浓度    0.5 M Na₂HPO₄

■ 配制量      1 L 

■ 配制方法    

1. 称量 134 g Na₂HPO₄·7H₂O 置于 1 L 烧杯中。 

2. 加入约 800 ml 的去离子水充分搅拌溶解。 

3. 加入 85%的 H3PO4（浓磷酸）调节溶液 pH 值至 7.2。 

4. 加去离子水定容至 1 L。 

5. 高温高压灭菌后，室温保存。 

Salmon DNA (鲑鱼精 DNA)

■ 组份浓度    10 mg/ml Salmon DNA

■ 配制量      约 100 ml

■ 配制方法    

1. 称取鲑鱼精 DNA 2 g 置于 500 ml 烧杯中，加入约 200 ml的 TE Buffer。 

2. 用磁力搅拌器室温搅拌 2～4 小时，溶解后加入 4 ml 的5 M NaCl，使其终浓度为 0.1 M。 

3. 用苯酚和苯酚/氯仿各抽提 1 次。 

4. 回收水相溶液后，使用 17 号皮下注射针头快速吸打溶液约 20 次，以切断 DNA。 

5. 加入 2 倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。 

6. 离心回收 DNA 后，溶解于 100 ml 的去离子水中，测定溶液的 OD260 值。 

7. 计算溶液的 DNA 浓度后，稀释 DNA 溶液至 10 mg/ml。 

8. 煮沸 10 分钟后，分装成小份（1 ml/份）。-20℃保存。 

9. 使用前在沸水浴中加热 5 分钟后，迅速冰浴冷却。 

DNA 变性缓冲液

■ 组份浓度    1.5 M NaCl，0.5 M NaOH

■ 配制量      1 L 

■ 配制方法    

1. 称量下列试剂，置于 1 L 烧杯中。 

 NaCl 87.7 g  

 NaOH   20 g

2. 向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 

3. 加去离子水将溶液定容至 1 L 后，室温保存。 

预杂交液/杂交液(DNA 杂交用) 

■ 组份浓度                   

6×  SSC（或 SSPE） 

5×  Denhardt’s 

0.5%（W/V） SDS 

100 μg/ml  Salmon DNA 

■ 配制量      100 ml 

■ 配制方法    

1. 称量下列试剂，置于 200 ml 烧杯中。 

20×SSC（或 SSPE）    30 ml 

50×Denhardt’s             10 ml 

10% SDS               5 ml

10 mg/ml Salmon DNA       1 ml 

dH₂O                            54 ml

2. 充分混匀后，使用 0.45 μm 滤器滤去杂质后使用。 

预杂交液/杂交液(RNA 杂交用) 

■ 组份浓度                   

6×  SSC（或 SSPE）

5×  Denhardt’s 

0.5%（W/V） SDS 

100 μg/ml  Salmon DNA 

50%（V/V） Formamide 

■ 配制量      100 ml 

■ 配制方法    

1. 称量下列试剂，置于 200 ml 烧杯中。 

20×SSC（或 SSPE）       30 ml 

50×Denhardt’s        10 ml

10% SDS               5 ml

10 mg/ml Salmon DNA   1 ml 

Formamide                    50 ml 

dH₂O                         4 ml

2. 充分混匀后，使用 0.45 μm 滤器滤去杂质后使用。 

膜转移缓冲液 (Western 杂交用)

■ 组份浓度    39 mM Glycine，48 mM Tris，0.037%（W/V）SDS，20%（V/V）甲醇

■ 配制量      1 L

■ 配制方法    

1. 称量下列试剂，置于 1 L 烧杯中。 

 Glycine 2.9 g 

 Tris          5.8 g 

 SDS      0.37 g

2. 向烧杯中加入约 600 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 

3. 加去离子水将溶液定容至 800 ml 后，加入 200 ml 的甲醇。 

4. 室温保存。 

TBST Buffer (Western 杂交膜清洗液)

■ 组份浓度    20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.05%（V/V）Tween 20

■ 配制量      1 L

■ 配制方法    

1. 称量下列试剂，置于 1 L 烧杯中。 

 NaCl                              8.8 g

1 M Tris-HCl（pH8.0）        20 ml 

2. 向烧杯中加入约 800 ml 的去离子水，充分搅拌溶解。 

3. 加入 0.5 ml Tween 20 后充分混匀。 

4. 加去离子水将溶液定容至 1 L 后，4℃保存。 

封闭缓冲液 (Western 杂交用)

■ 组份浓度    5%（W/V）脱脂奶粉/TBST Buffer

■ 配制量      100 ml

■ 配制方法    

1. 称量 5 g 脱脂奶粉加入到 100 ml 的 TBST Buffer 中，充分搅拌溶解。 

2. 4℃保存待用（本封闭液应该现配现用）。